La multirésistance des bactéries aux antibiotiques est un risque majeur de santé publique dans les décennies à venir. La résistance est liée à des modifications dans le patrimoine génétique des bactéries, qui apparaissent de manière spontanée, mais dont l’émergence et la transmission sont accélérées par l’utilisation intensive ou le mauvais usage des antibiotiques. Parmi les phénomènes impliqués dans la diminution de la sensibilité des bactéries à un antibiotique, figure en particulier la production d’enzymes qui inactivent l’antibiotique. Les gènes codant ces enzymes peuvent être insérés dans des transposons¹, qui peuvent être présents dans des plasmides capables de passer d’une bactérie à une autre, appartenant ou non à la même espèce bactérienne, et qui peuvent ainsi disséminer largement les gènes de résistance. Pour lutter contre l’invasion par les bactériophages² et d’autres éléments génétiques mobiles, les bactéries ont acquis tout un arsenal de systèmes de défense. Certains d’entre eux, comme les systèmes de restriction-modification et les systèmes CRISPR, sont également capables de protéger les bactéries contre l’entrée des plasmides [1] (→).

(→) Voir la Nouvelle de A. Friot et al., m/s n° 5, mai 2018, page 396

L’acquisition d’un plasmide porteur d’un gène de résistance confère à la bactérie un avantage sélectif lors d’un traitement par l’antibiotique ciblé par ce gène. Elle continue à pouvoir se multiplier, alors que les bactéries qui n’ont pas reçu le gène de résistance sont éliminées. En revanche, en absence de l’antibiotique, la présence du plasmide peut entraîner un « coût » évolutif (en anglais, fitness cost) pour la bactérie, qui se multipliera moins vite que les bactéries sans plasmide. Le transfert du gène de résistance du plasmide vers le chromosome bactérien et la perte du plasmide permettront à la bactérie de conserver un avantage sélectif en présence de l’antibiotique tout en réduisant le coût évolutif lié au plasmide. L’analyse des génomes de souches bactériennes isolées par les laboratoires hospitaliers met en évidence des cas d’intégration de gènes de résistance dans le chromosome bactérien. Il importe de comprendre les facteurs qui régissent le transfert des gènes de résistance entre différentes bactéries, et au sein d’une même bactérie, entre différents supports génétiques, afin d’imaginer des stratégies pour prévenir l’apparition de bactéries multirésistantes.

Les carbapénèmes font partie des antibiotiques utilisés pour traiter les infections par des bactéries multirésistantes. Ce sont des β-lactamines, donc appartenant à la même famille d’antibiotiques que les pénicillines, mais capables d’éliminer un large spectre de bactéries résistantes aux autres β-lactamines, et notamment aux céphalosporines de deuxième et troisième générations. Les carbapénèmes sont considérés comme des antibiotiques de dernier recours, qui sont néanmoins inactivés par certaines β-lactamases : les carbapénémases. Les entérobactéries productrices de carbapénémase et résistantes aux carbapénèmes sont considérées par l’Organisation mondiale de la santé comme une priorité pour le développement de nouveaux antibiotiques [2]. En Europe, notamment en France, la carbapénémase la plus fréquemment retrouvée est la carbapénémase OXA-48 [3], dont le gène de structure, bla_OXA-48, est le plus souvent porté par une famille de plasmides appelés pOXA-48 [4]. Ces plasmides sont caractérisés par un taux de conjugaison³ élevé, qui favorise leur dissémination. Un lignage particulier d’Escherichia coli, fréquemment isolé d’infections humaines, appelé ST38, présente la particularité de porter préférentiellement les gènes de résistance, notamment le gène bla_OXA-48, dans son chromosome plutôt que dans des plasmides [5]. Nous avions récemment montré qu’il existe, disséminés en Europe, au moins quatre clones de E. coli ST38 portant le gène bla_OXA-48 inséré dans le chromosome [6]. Le lignage ST38 constituait donc un modèle pour tenter de comprendre les facteurs favorisant la mobilité des gènes de résistance d’un plasmide vers le chromosome.

Par des approches d’évolution expérimentale (Figure 1), nous avons pu reproduire le phénomène d’intégration du gène bla_OXA-48 dans le chromosome de E. coli [7]. Au cours de ces expériences, nous avons cultivé trois souches de E. coli ST38 contenant trois versions du plasmide pOXA-48 pendant 28 jours, en transférant chaque jour une partie de la culture de la veille dans du milieu de culture neuf (Figure 1). Cela correspond à une multiplication des bactéries pendant environ 220 générations. Un carbapénème, le méropénème, a été ajouté régulièrement pour sélectionner les bactéries qui conservaient le gène bla_OXA-48. Nous avions en effet montré qu’en absence de l’antibiotique, ces souches ST38 perdaient rapidement leurs plasmides pOXA-48. Par ailleurs, la présence de ces plasmides entraînait des coûts évolutifs différents en fonction de la souche utilisée. À la fin de ces expériences, nous avons étudié les modifications génétiques apparues, par séquençage du génome des populations bactériennes évoluées et de colonies isolées. Nous avons constaté que, pour certaines combinaisons de souches ST38 et de plasmide pOXA-48, la quasitotalité des bactéries avaient perdu le plasmide, avaient intégré le gène de résistance dans leur chromosome, et avaient retrouvé un taux de croissance équivalent à la souche sans plasmide. Cela nous a permis d’identifier trois conditions, en plus de la sélection par l’antibiotique, pour que se produise l’intégration chromosomique du gène de résistance. Le coût de fitness induit par la présence du plasmide dans la bactérie doit être suffisamment élevé. Le gène de résistance doit être porté par un transposon pour permettre sa capture par le chromosome. Et, ce qui est nouveau, la bactérie doit éliminer activement le plasmide grâce à la production de protéines à activité antiplasmide (Figure 2). En effet, nous avons constaté que les bactéries qui n’avaient pas intégré le gène de résistance dans leur chromosome et avaient conservé le plasmide présentaient très souvent des mutations dans un des deux gènes d’un opéron que nous avons appelé apsAB (antiplasmid system AB). Ces bactéries ne perdaient plus le plasmide pOXA-48 au cours du temps, même quand elles étaient cultivées en absence de l’antibiotique. De plus, aucune intégration de bla_OXA-48 n’était observée quand apsAB était inactivé dans les bactéries utilisées pour les expériences d’évolution. Les deux protéines ApsA et ApsB codées par cet opéron sont nécessaires pour entraîner la perte du plasmide pOXA-48 (Figure 2). Ces protéines agissent sur pOXA-48, mais aussi sur d’autres plasmides de types différents.

Figure 1. Principe de l’évolution expérimentale. Une population de bactéries identiques génétiquement est cultivée au laboratoire pendant 28 jours (J0-J28) par repiquages successifs dans du milieu de culture neuf. Au cours de cette culture, des changements génétiques (e.g. mutations, mouvements de transposons, perte de plasmides) apparaissent de manière aléatoire dans certaines bactéries. Si ce changement est avantageux pour la bactérie, celle-ci va se multiplier plus vite que celles qui n’ont pas eu le changement, et progressivement devenir majoritaire dans la culture. À la fin de l’expérience, le changement pourra être caractérisé en séquençant le génome de la population bactérienne ou d’un certain nombre de bactéries issues de la culture finale ou d’échantillons intermédiaires. Pour éliminer tout changement génétique qui aurait pu survenir de manière aléatoire, seuls les changements identifiés lors de plusieurs expériences indépendantes sont considérés comme significatifs.

Figure 2. Mécanismes de l’intégration chromosomique de blaOXA-48. Le transposon portant le gène blaOXA-48 est transféré du plasmide au chromosome bactérien. Ce phénomène de transposition est rare, mais peut être sélectionné efficacement grâce à l’élimination du plasmide par le système de défense ApsAB. En présence de l’antibiotique, seules les bactéries portant le gène de résistance survivent. Ainsi les bactéries ayant intégré blaOXA-48 et perdu le plasmide à la suite de sa dégradation par ApsAB survivent et deviennent dominantes dans la population bactérienne. Ces bactéries survivantes constituent de nouveaux clones émergents résistants à l’antibiotique.

En recherchant des protéines similaires dans les bases de données issues du séquençage des génomes bactériens, nous avons découvert que ApsAB représente le prototype pour une nouvelle famille de systèmes anti-plasmides exprimés dans des bactéries très diverses. Par des analyses in silico, nous avons prédit que ce système associerait une nucléase capable de dégrader certains acides nucléiques (ApsA) et une protéine de type Argonaute (ApsB) qui, en se liant à des oligonucléotides de types ARN ou ADN utilisés comme séquences guides, dirigerait la nucléase vers certains plasmides. Les protéines argonautes étaient déjà connues, chez les eucaryotes, pour leur activité dans l’interférence par ARN [8]. Chez les procaryotes, leurs structures et leurs activités sont plus diverses [9]. Bien qu’un certain nombre possèdent une activité nucléase, d’autres, comme ApsB, n’ont pas une telle activité, qui est apportée par une protéine associée, ici la nucléase ApsA. Un autre système antiplasmide composé d’une protéine de type argonaute et d’une protéine à activités nucléase et hélicase contribue à l’absence de plasmide dans la souche El Tor de Vibrio cholerae, responsable de la septième pandémie de choléra [10].

En conclusion, ces résultats expérimentaux ont fait sensiblement progresser notre compréhension du phénomène de fixation des gènes de résistance aux antibiotiques au sein des chromosomes bactériens. C’est aussi la découverte d’une nouvelle famille de systèmes anti-plasmides qui jouerait un rôle dans les interactions entre bactéries et plasmides, donc dans la circulation de ces vecteurs de la résistance aux antibiotiques.

Liens d’intéret

Les auteurs déclarent n’avoir aucun lien d’intérêt concernant les données publiées dans cet article.

Références

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Liste des figures

Figure 1. Principe de l’évolution expérimentale. Une population de bactéries identiques génétiquement est cultivée au laboratoire pendant 28 jours (J0-J28) par repiquages successifs dans du milieu de culture neuf. Au cours de cette culture, des changements génétiques (e.g. mutations, mouvements de transposons, perte de plasmides) apparaissent de manière aléatoire dans certaines bactéries. Si ce changement est avantageux pour la bactérie, celle-ci va se multiplier plus vite que celles qui n’ont pas eu le changement, et progressivement devenir majoritaire dans la culture. À la fin de l’expérience, le changement pourra être caractérisé en séquençant le génome de la population bactérienne ou d’un certain nombre de bactéries issues de la culture finale ou d’échantillons intermédiaires. Pour éliminer tout changement génétique qui aurait pu survenir de manière aléatoire, seuls les changements identifiés lors de plusieurs expériences indépendantes sont considérés comme significatifs.

Dans le texte

Figure 2. Mécanismes de l’intégration chromosomique de blaOXA-48. Le transposon portant le gène blaOXA-48 est transféré du plasmide au chromosome bactérien. Ce phénomène de transposition est rare, mais peut être sélectionné efficacement grâce à l’élimination du plasmide par le système de défense ApsAB. En présence de l’antibiotique, seules les bactéries portant le gène de résistance survivent. Ainsi les bactéries ayant intégré blaOXA-48 et perdu le plasmide à la suite de sa dégradation par ApsAB survivent et deviennent dominantes dans la population bactérienne. Ces bactéries survivantes constituent de nouveaux clones émergents résistants à l’antibiotique.

Dans le texte