L’immunité innée impliquant cGAS

L’immunité innée est la première ligne de défense des cellules contre des microorganismes pathogènes. Cette réponse immunitaire de la cellule repose sur la détection de motifs spécifiques présents sur les microorganismes (pathogenassociated molecular patterns, PAMP) par des récepteurs cellulaires (pattern recognition receptors, PRR). La liaison PAMP-PRR conduit à une cascade de signalisation aboutissant à une réponse interféron et à la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires. Un des acteurs majeurs de l’immunité innée est la protéine cGAS (cyclic GMP-AMP synthase) [1]. cGAS reconnaît l’ADN présent dans le cytoplasme : ADN étranger d’origine virale lors d’une infection, ou ADN d’origine nucléaire et mitochondriale lors d’un stress ou de lésions cellulaires. La présence d’ADN double brin dans le cytoplasme active cGAS, qui synthétise le second messager cGAMP (2’3’ cyclic GMP-AMP), qui se lie alors à l’adaptateur STING (stimulator of interferon genes), localisé à la surface du réticulum endoplasmique. L’activation de STING entraîne sa relocalisation à l’appareil de Golgi et le déclenchement d’une cascade de phosphorylation aboutissant à la translocation nucléaire des facteurs de transcription IRF3 (interferon regulatory factor 3) et NF-κB (nuclear factor kappa B), ce qui entraîne la production d’interféron et l’expression de gènes stimulés par l’interféron (interferon-stimulated genes, ISG), ainsi que la production de cytokines pro-inflammatoires. On a longtemps pensé que la localisation cytoplasmique de cGAS permettait d’empêcher son activation par l’ADN présent dans le noyau, l’enveloppe nucléaire jouant le rôle de barrière évitant ainsi toute auto-réactivité. Cependant, il a récemment été montré qu’une majorité de la protéine cGAS se situe en réalité dans le noyau, où son rôle est encore mal compris [2]. En effet, il a été montré que cGAS y est maintenue dans un état inactif par sa liaison aux histones H2A/H2B, mais les résultats de certaines études indiquent qu’elle pourrait aussi exercer un rôle actif de détection d’ADN étranger présent dans le noyau, notamment l’ADN des virus de la famille herpesviridae et du virus de l’immunodéficience humaine de type 2 (VIH-2) [3,4] (Figure 1).

Figure 1. Activation cytoplasmique et inhibition nucléaire de cGAS. Dans le cytoplasme (à gauche), la détection d’ADN double brin par la protéine cGAS conduit à sa dimérisation et à la production du second messager 2’-3’ cGAMP. Cela entraîne l’activation de STING et la translocation nucléaire de NF-kB et de dimères IRF3 phosphorylés, conduisant à la production de cytokines pro-inflammatoires et d’interféron (IFN) de type I. Dans le noyau (à droite), cGAS est fortement liée au nucléosome, ce qui empêche sa dimérisation. Elle est ainsi maintenue dans un état inactif sur l’ADN génomique. Figure réalisée avec BioRender.

Le VIH-1, un virus discret

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est un rétrovirus appartenant au genre lentivirus. Lors de l’infection d’une cellule cible (lymphocyte T CD4⁺, macrophage, cellule dendritique), son génome à ARN est rétrotranscrit en ADN, qui s’intègre dans le génome de cette cellule. L’infection par le VIH-1 n’induit pas de réponse immunitaire innée, ce qui facilite sa réplication [5]. Cela est dû à la mise en place de mécanismes d’échappement : en particulier, la capside virale joue un rôle clé pour protéger les acides nucléiques viraux des détecteurs d’ARN et d’ADN cytoplasmiques lors de leur transport vers le noyau [6]. L’ADN viral ne se trouve exposé qu’une fois dans le noyau, après ouverture de la capside, à proximité du site d’intégration dans l’ADN de la cellule. Une fois intégré, l’ADN viral devient impossible à distinguer de l’ADN cellulaire, mais, entre l’ouverture de la capside et son intégration, il est exposé aux détecteurs localisés dans le noyau, en particulier à cGAS. Comment l’ADN viral échappe-il à la réponse immunitaire innée avant son intégration dans le génome cellulaire ?

L’ADN non intégré du VIH-1 possède une structure chromatinienne répressive

Pour répondre à cette question, il importe de comprendre la structure de l’ADN viral avant son intégration dans le génome cellulaire. Lorsque l’ADN viral est importé dans le noyau, il est rapidement chromatinisé. Contrairement à l’ADN intégré, dont la transcription active assure la réplication virale, l’ADN non intégré possède une structure chromatinienne répressive et est transcriptionnellement silencieux [7, 8]. Cela se traduit par la présence de marques épigénétiques répressives telles que la triméthylation de l’histone H3 sur la lysine en position 9 (H3K9me3), la présence de l’histone de liaison H1 qui participe à la compaction de la chromatine, et la présence, au promoteur viral LTR (long terminal repeat), d’un nucléosome additionnel, qui sera retiré après intégration de l’ADN viral [8]. Quels sont les facteurs cellulaires impliqués dans cette répression transcriptionnelle transitoire ? Quelle est la conséquence de cette répression pour la réplication du virus et pour l’induction de la réponse immunitaire innée ?

La protéine POLE3 maintient l’ADN viral non intégré dans un état chromatinien répressif

Une analyse protéomique des fragments isolés de la chromatine (proteomics of isolated chromatin loci, PICh) nous a permis de déterminer la composition protéique de la chromatine associée à l’ADN viral avant son intégration. Nous avons ainsi découvert que la protéine POLE3, une sous-unité non essentielle de la polymérase epsilon (POL e), était associée à cet ADN [9]. Afin de déterminer le rôle de cette association, nous avons utilisé un virus mutant dont la protéine effectuant l’intégration (intégrase) est inactivée (VIH-1 IN^D116A), ce qui permet d’obtenir uniquement des formes non intégrées de l’ADN viral. L’infection de différentes lignées cellulaires et de lymphocytes T CD4⁺ primaires déplétés pour la protéine POLE3, par la technique d’ARN interférents ou par le système CRISPR-Cas9, nous a permis de montrer que POLE3 agit comme un répresseur transcriptionnel de l’ADN viral non intégré, en maintenant une structure chromatinienne répressive. En effet, la déplétion de POLE3 induit une diminution du recrutement de l’histone H1 ainsi qu’une augmentation de l’acétylation de l’histone H3 (H3ac), une marque associée à une transcription active. En outre, l’absence de POLE3 inhibe fortement la réplication virale, ce qui suggère que le maintien d’une structure chromatinienne dense, répressive pour la transcription de l’ADN viral non intégré est nécessaire pour une réplication optimale du virus. Nous avons exploré deux hypothèses non exclusives pour expliquer l’effet inhibiteur de la déplétion de POLE3 sur la réplication du virus : d’une part, la modification de l’état chromatinien de l’ADN viral diminue l’efficacité de son intégration, potentiellement en perturbant l’action de l’intégrase par encombrement stérique ; d’autre part, alors que l’infection par le VIH-1 n’induit pas de réponse immunitaire innée, l’ouverture de la structure chromatinienne de son ADN viral non intégré déclenche cette réponse lors de l’infection des lymphocytes T CD4⁺ primaires, comme en témoigne la production d’interféron β et des protéines ISG15, IFIT1 et IFIT2.

La protéine cGAS interagit avec la chromatine associée à l’ADN viral non intégré

Le constat, en absence de POLE3, d’une réponse immunitaire innée après l’infection par le virus mutant IN^D116A pose la question de l’implication de la protéine cGAS dans ce phénotype [10]. En effet, cGAS est un acteur majeur de la reconnaissance de l’ADN double brin, et est présente en abondance dans le noyau cellulaire, où l’ADN viral non intégré est exposé. Or, lorsqu’on ajoute à l’absence de POLE3, la déplétion ou l’inhibition de cGAS, la réponse immunitaire innée à l’infection virale diminue, et la réplication du virus est partiellement restaurée, témoignant de l’importance de l’échappement de l’ADN viral à la détection par cGAS pour assurer une réplication virale efficace. Pour déclencher son activité catalytique, la protéine cGAS se lie à l’ADN nu, ce qui permet sa dimérisation et la production de 2’-3’ cGAMP. Sur les nucléosomes, la protéine cGAS se lie à la poche acide située à l’interface des histones H2A et H2B par ses résidus arginine (basiques) R236 et R255 avec une affinité supérieure à celle de sa liaison à l’ADN nu, ce qui empêche sa dimérisation, inhibant donc son activité enzymatique. Par des expériences d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) dans des cellules produisant la protéine cGAS mutée sur les résidus R236 et R255, incapable de se lier à la chromatine, ou la protéine non mutée, nous avons montré que cGAS est recrutée sur l’ADN viral non intégré via son site de liaison aux histones, ce qui entraîne son inactivation.

Perspectives

Nous avons découvert un nouveau mécanisme d’échappement à cGAS, par lequel la structure chromatinienne « fermée » de l’ADN du virus VIH-1 avant son intégration dans le génome cellulaire permet le recrutement de cGAS de manière à inhiber son activité enzymatique, assurant ainsi une réplication efficace du virus. À la différence d’autres mécanismes d’échappement connus, aucune protéine virale n’est impliquée dans le cas du VIH-1, qui utilise un mécanisme cellulaire d’inhibition de cGAS (Figure 2). Au-delà de leurs implications pour la compréhension de l’immunité innée antivirale, les résultats de cette étude ouvrent la possibilité de comprendre les mécanismes du contrôle physiologique de l’activité de cGAS dans le noyau cellulaire afin d’éviter l’auto-réactivité avec l’ADN génomique, tout en assurant son activation dans les contextes de danger, tels que des dommages à l’ADN ou une infection de la cellule. Il conviendra notamment d’identifier les déterminants cellulaires favorisant l’interaction cGAS-nucléosome dans un contexte de chromatine dense, ou l’interaction cGAS-ADN lorsque la chromatine est plus ouverte.

Figure 2. La structure chromatinienne de l’ADN viral non intégré du VIH-1 maintient cGAS dans un état inactif. Dans le cytoplasme, la capside du VIH-1 protège les acides nucléiques viraux de cGAS. Dans le noyau, la chromatinisation de l’ADN viral non intégré influe directement sur détection par cGAS : lorsque la chromatine est dense, cGAS se lie aux nucléosomes de la même manière que sur l’ADN génomique, conduisant à son inactivation ; lorsque la chromatine est décondensée, cGAS se lie directement à l’ADN viral, induisant une réponse interféron. LTR : long terminal repeat. Figure réalisée avec BioRender.

Liens d’intérêt

Les auteurs déclarent n’avoir aucun lien d’intérêt concernant les données publiées dans cet article.

Références

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Liste des figures

Figure 1. Activation cytoplasmique et inhibition nucléaire de cGAS. Dans le cytoplasme (à gauche), la détection d’ADN double brin par la protéine cGAS conduit à sa dimérisation et à la production du second messager 2’-3’ cGAMP. Cela entraîne l’activation de STING et la translocation nucléaire de NF-kB et de dimères IRF3 phosphorylés, conduisant à la production de cytokines pro-inflammatoires et d’interféron (IFN) de type I. Dans le noyau (à droite), cGAS est fortement liée au nucléosome, ce qui empêche sa dimérisation. Elle est ainsi maintenue dans un état inactif sur l’ADN génomique. Figure réalisée avec BioRender.

Dans le texte

Figure 2. La structure chromatinienne de l’ADN viral non intégré du VIH-1 maintient cGAS dans un état inactif. Dans le cytoplasme, la capside du VIH-1 protège les acides nucléiques viraux de cGAS. Dans le noyau, la chromatinisation de l’ADN viral non intégré influe directement sur détection par cGAS : lorsque la chromatine est dense, cGAS se lie aux nucléosomes de la même manière que sur l’ADN génomique, conduisant à son inactivation ; lorsque la chromatine est décondensée, cGAS se lie directement à l’ADN viral, induisant une réponse interféron. LTR : long terminal repeat. Figure réalisée avec BioRender.

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