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De Sanger au NGS (new generation sequencing)

Le premier séquençage d’un génome humain, réalisé de 1990 à 2001, fut effectué en utilisant une version automatisée de la technique de Sanger¹, apparue dès 1977. Vers la fin de ce projet, qui impliqua de nombreux laboratoires à travers le monde et mobilisa des crédits totalisant près de trois milliards de dollars, on estimait que, compte tenu des progrès techniques et organisationnels, l’établissement d’une nouvelle séquence génomique humaine coûtait environ cent millions de dollars (environ 91 millions d'euros). À partir de 2002, de nouvelles techniques reposant sur une combinaison de micromécanique, d’enzymologie sophistiquée et d’optique de précision permirent la lecture simultanée de millions de molécules d’ADN et autorisèrent une accélération considérable des travaux et un abaissement spectaculaire des coûts de séquençage [1, 2] (→).

(→) Voir la Chronique génomique de B. Jordan, m/s n° 10, octobre 2008, page 869

Vers 2010, le coût de l’établissement d’une séquence génomique humaine était tombé à environ dix mille dollars (environ 9000 euros) pour une séquence de bonne qualité [3] ( Figure 1 ), soit un génome haploïde (trois mille mégabases²), lu avec une redondance moyenne de trente fois (30X) et un taux d’erreurs inférieur à 1/1000.

Figure 1. Évolution du coût du séquençage d’un génome humain au cours des vingt dernières années (noter l’échelle logarithmique). Le point d’inflexion vers 2005 correspond à l’arrivée des approches NGS (new generation sequencing). Début 2023, le coût revendiqué par Illumina est de deux cents dollars par génome. Source : NHGRI (National Human Genome Research Institute).

Les acteurs de ce domaine appelé NGS (new generation sequencing) étaient assez nombreux au début, mais au fil des années, beaucoup disparurent (454, Helicos, Solid, Complete Genomics, etc.) pour ne laisser, vers la fin des années 2010, que trois intervenants principaux : l’entreprise nord-américaine Illumina en position dominante (environ 90 % du marché), et deux concurrents, le Californien Pacific Biosciences (PacBio) et le Britannique Oxford Nanopore Technologies (ONT). Reste aussi un acteur marginal, Ion Torrent (Thermo Fisher), spécialisé dans les tests cliniques à bas débit, et un concurrent chinois, MGI tech, dont nous parlerons plus bas. Il est important de noter que la technologie Illumina est orientée vers la lecture à très haut débit de séquences courtes (cent à deux cents bases) alors que PacBio et ONT permettent, avec des approches différentes, des lectures très longues portant sur des dizaines de kilobases. En termes comparatifs, Illumina annonce les coûts de séquençage les plus bas, PacBio offre, outre les lectures longues, une très bonne qualité de lecture mais à un coût plus élevé. ONT présente des avantages au niveau de sa mise en œuvre et permet des lectures très longues, mais le coût du séquençage est relativement élevé et le taux d’erreur supérieur à celui de ses concurrents [4].

2023 : vers le génome à cent dollars ?

Avec l’augmentation des débits et l’abaissement des coûts, de nouveaux projets impliquant le séquençage de milliers de génomes humains deviennent possibles : citons, par exemple, la lecture intégrale du demi-million d’ADN collecté dans le cadre de la UK Biobank, déjà bien avancée [5] ou le projet de séquençage de toutes les espèces vivantes [6, 7]. En regard, les machines sont de plus en plus puissantes. Le dernier modèle d’Illumina, la NovaSeq X plus, peut lire en deux jours 16 térabases de séquence brute, soit près de deux cents génomes de séquence finie répondant aux critères déjà cités. Le coût annoncé est d’environ deux dollars par gigabase de séquence brute : un génome humain de trois gigabases lu avec une redondance de 30X reviendrait ainsi à moins de deux cents dollars. Il s’agit là du coût total en réactifs et informatique, depuis la préparation des librairies jusqu’à l’assemblage de la séquence : l’amortissement du matériel et les salaires du personnel ne sont pas comptabilisés, mais compte tenu du volume de la production (plusieurs milliers de génomes par mois) les réactifs restent la principale dépense. Illumina, qui emploie plus de onze mille personnes et dispose d’une gamme complète de machines, en a vendu à ce jour plus de vingt mille, à un prix unitaire qui va d’un demi-million à plus d’un million de dollars. Avec une part de marché en 2022 qui reste supérieure à 70 %, cette firme est encore en position dominante. Mais elle fait désormais face à une concurrence sérieuse, tant de la part d’acteurs déjà existants que de plusieurs nouveaux venus [8].

Compétition sur les séquences courtes

Dans le secteur des séquences courtes, jusqu’ici fief quasiment exclusif d’Illumina (du moins dans le monde occidental), il existe un concurrent chinois bien implanté en Extrême-Orient mais jusqu’ici peu présent en Occident. Il s’agit de MGI tech, une entreprise issue du géant BGI (anciennement Beijing Genomics Institute), qui avait racheté la technologie de Complete Genomics après sa faillite en 2013 et qui a développé une gamme complète de séquenceurs d’ADN³. Les performances de ces machines sont du même ordre que celles d’Illumina (les formats de données sont d’ailleurs compatibles) et la qualité des séquences obtenues semble équivalente. Les prix des machines et des réactifs sont, eux, très concurrentiels. La firme MGI tech compte plus de deux mille employés et a vendu un bon millier de machines, mais est pour le moment très peu présente en Europe et en Amérique du Nord : Illumina a longtemps réussi à empêcher son implantation grâce à des procès portant sur la technique de séquençage, mais les tribunaux ont récemment rendu une décision favorable à MGI tech qui peut désormais commercialiser ses systèmes sans restriction. Cette entreprise peut donc concurrencer Illumina sur son marché principal, avec de sérieuses références, des tarifs agressifs et une gamme complète d’appareils, dont des systèmes à très haut débit encore plus performants (sur le papier) que ceux d’Illumina ( Figure 2 ).

Figure 2. Du très haut de gamme : le système « DNBSEQ-T10x4RS » proposé par MGI/Complete Genomics, qui rassemble plusieurs appareils servis par un bras robotique et pour lequel l’entreprise revendique une production de 76 térabases (de séquence brute) en une session de quatre jours environ. Extrait du site de MGI-Tech (https://en.mgi-tech.com/products/).

Reste que les usagers risquent d’hésiter à abandonner un fournisseur connu pour un nouveau venu dont le service après-vente en Occident est une inconnue⁴, et qui, de plus, émane d’un pays avec lequel les relations sont plus que délicates : il ne faudrait pas que MGI tech subisse le destin de Huawei ou de TicTok, produits chinois désormais interdits (ou presque) aux États-Unis… Mais MGI tech n’est pas le seul à s’aventurer sur le pré carré d’Illumina : plusieurs nouveaux arrivants annoncent ou commercialisent déjà des systèmes assez proches de la technologie Illumina mais promettant un coût inférieur et/ou une plus grande flexibilité. On peut citer à cet égard Element Biosciences, qui commercialise déjà une machine de moyenne gamme (lecture de 1 térabase par session, contre 16 pour le NovaSeq X Illumina, avec un coût d’acquisition raisonnable et une grande flexibilité), Ultima Genomics qui va mettre sur le marché une machine à très haut débit censée faire descendre le coût (toujours en réactifs) à un dollar par gigabase de séquence brute (soit un génome humain 30X pour cent dollars), et aussi Singular Genomics qui a commencé à vendre une machine de milieu de gamme, un peu comme Element Biosciences. Quelles sont les chances de ces nouveaux venus ? Ce sont des entreprises de petite taille, non encore implantées sur le marché, et qui s’attaquent au market leader en proposant des systèmes assez similaires mais un peu plus commodes ou un peu moins chers. On peut être assez sceptique sur leurs chances de succès. MGI tech, par contre, pourrait bien tailler des croupières à Illumina si les évolutions géopolitiques ne se mettent pas en travers de son chemin.

La montée en puissance des séquences longues

L’obtention de séquences longues (plusieurs dizaines ou même centaines de kilobases lues d’un seul tenant) présente de nombreux avantages. C’est particulièrement évident pour le séquençage de novo d’un génome encore inconnu, pour lequel on ne dispose pas de séquence de référence permettant l’assemblage des millions de courtes séquences lues au hasard ; mais, même pour un génome humain, cela permet de s’affranchir des problèmes liés aux séquences répétées, de repérer facilement délétions, duplications et inversions, et de définir les haplotypes⁵ en déterminant quels allèles sont associés sur la même molécule d’ADN. Ces avantages sont si évidents qu’Illumina propose des processus permettant (plus ou moins) d’associer plusieurs lectures courtes pour simuler une lecture longue (synthetic reads). Les systèmes PacBio et ONT, eux, lisent directement de très longs fragments d’ADN. Pour PacBio, cela repose sur un système optique très sophistiqué dont la sensibilité permet la lecture d’une seule molécule, et non d’un mélange de courts produits d’amplification par PCR (polymerase chain reaction). Fondée en 2004, la firme reste de dimensions modestes (sept cent cinquante employés, un demi-millier d'appareils installés) et est longtemps restée cantonnée à un marché de niche complémentaire à celui d’Illumina en raison de son coût élevé et d’un important taux d’erreurs. Mais des améliorations récentes lui ont permis d’atteindre le taux d’erreurs de référence, un débit élevé (une térabase de séquence par session) et un coût nettement abaissé correspondant à mille dollars (environ 900 euros) pour un génome humain [8]. C’est encore cinq fois plus cher que le dernier chiffre d’Illumina, mais les avantages des lectures longues peuvent justifier la différence. Le consortium Telomere to Telomere, qui vise le séquençage intégral et sans aucune interruption de tous les chromosomes humains [9, 10] (→) a, par exemple, choisi de faire reposer l’essentiel de ses travaux sur cette approche. À l’avenir, PacBio pourrait passer du statut de technologie complémentaire à celui de concurrent d’Illumina. Cette dernière firme l’a bien compris et a tenté d’acheter PacBio (pour 1,2 milliards de dollars, environ 1,08 milliards d'euros) en 2019, mais la transaction a été bloquée par la Federal Trade Commission et par l’Autorité de la Concurrence européenne en vertu des réglementations antitrust.

(→) Voir la Chronique génomique de B. Jordan, m/s n° 1, janvier 2019, page 81

L’autre intervenant dans le secteur des séquences longues est Oxford Nanopore Technology (ONT) qui, comme son nom l’indique, met en œuvre la technique des nanopores [11, 12] (→).

(→) Voir la Chronique génomique de B. Jordan, m/s n° 8-9, août-septembre 2017, page 801 et la Synthèse de F. Montel, m/s n° 2, février 2018, page 161

Il s’agit de faire passer les molécules d’ADN à travers des pores microscopiques, et d’interpréter les petites variations électriques produites par ce passage pour identifier les bases. ONT a réussi à mettre en œuvre cette approche sous forme d’une cartouche à peine plus grosse qu’une clef USB, contenant une membrane qui comporte un demi-millier de pores ( Figure 3 ). Cette cartouche, qui coûte moins d’un millier d’euros, est branchée sur un ordinateur portable et l’échantillon est déposé sur la membrane. En quelques heures, ce système produit jusqu’à cinquante gigabases de séquence avec le cas échéant des lectures s’étendant sur des centaines de kilobases si l’ADN déposé est en bon état.

Figure 3. Le « séquenceur » d’Oxford Nanopore Technology, une cartouche d’une centaine de grammes qui peut produire de dix à cinquante gigabases de séquence (brute). Il ne lui manque qu’un ordinateur pour être fonctionnel. On appréciera la différence avec le « monstre » de la Figure 2… Extrait du site d’ONT (https://nanoporetech.com/products/specifications).

L’ensemble est ultra-portable (il existe des variants plus productifs associant jusqu’à 48 cartouches), rapide et sans investissement initial ; le coût par gigabase est de l’ordre de la centaine d’euros, bien plus élevé que les systèmes à très haut débit, mais compensé par l’absence d’investissement initial, la commodité (rapidité, portabilité) et la possibilité de lectures très longues (le record dépasse la mégabase). La qualité des séquences, assez mauvaise à l’origine [12], a été bien améliorée et se rapproche maintenant des standards du domaine. ONT reste une entreprise de taille moyenne (environ 400 employés) et a vendu presque dix mille systèmes allant de la cartouche individuelle aux systèmes multi-cartouches. Elle ne joue pas vraiment dans la même cour qu’Illumina ou même PacBio et va probablement principalement intervenir pour des séquençages ultra-rapides ou dans des conditions très rustiques (cf. son emploi dans le cadre de la récente épidémie d’Ebola [13]), pour la caractérisation de souches de SARS-CoV, ou encore pour des séquençages de novo d’organismes encore peu caractérisés.

Un champ réouvert

Après une dizaine d’années durant lesquelles la technologie Illumina, et la firme du même nom, ont dominé le marché du séquençage d’ADN, on voit que la compétition s’active à nouveau, et que le coût baisse encore, s’approchant aujourd’hui du « génome (humain) à cent dollars ». Cela ouvre un nouveau champ de possibilités puisque la lecture intégrale d’un ADN devient accessible pour le prix que coûtait un profil génétique par microarray il y a quelques années. Du coup, il devient envisageable, par exemple, de réaliser des balayages du génome (GWAS, genome-wide association studies) fondés sur la séquence plutôt que sur l’examen d’un million de SNP (single nucleotide polymorphism), de reprendre des questions d’anthropologie en séquençant des populations entières, ou encore d’appuyer une réinterprétation de la phylogénie sur la connaissance intégrale des génomes de très nombreuses espèces. Et bien sûr, l’utilisation de la séquence en clinique, déjà bien développée notamment pour la cancérologie, va pouvoir se généraliser.

Dans ce nouveau paysage, Illumina va sans doute rester en position dominante à moins d’erreurs stratégiques majeures⁶ : l’entreprise est très bien implantée et les chances de succès de nouveaux venus cassant les prix semblent assez faibles – à part le cas de MGI tech qui dispose de sérieux atouts mais risque de souffrir du contexte géopolitique. Mais l’approche des séquences longues va certainement se développer en raison de ses avantages scientifiques et de l’existence depuis peu de systèmes réellement performants. À cet égard, PacBio semble le mieux placé et peut réellement concurrencer Illumina, ONT se positionnant plutôt sur les applications cliniques, sur le séquençage de novo et sur les travaux sur le terrain.

On a là un bel exemple de progrès technique fulgurant, passant du génome à cent millions de dollars au génome à cent dollars en vingt ans seulement, comparable mais encore plus rapide que celui de l’informatique. Un progrès qui repose sur la remarquable capacité d’innovation scientifique et technique du système étatsunien⁷ : il est à cet égard intéressant de constater l’absence du Japon qui pouvait a priori sembler bien armé et a d’ailleurs lancé des projets dès les années 1990 [14] – mais cette nation ne dispose pas de l’efficace écosystème⁸ présent en Californie ou dans la région de Boston. En tous cas, soixante-dix ans après la découverte de la structure en double hélice de l’ADN et vingt ans après le premier séquençage d’un génome humain, l’accès aisé aux séquences de ces molécules n’a pas fini de transformer notre compréhension de la biologie.

Liens d’intérêt

L’auteur déclare n’avoir aucun lien d’intérêt concernant les données publiées dans cet article.

Références

Liste des figures

	Figure 1. Évolution du coût du séquençage d’un génome humain au cours des vingt dernières années (noter l’échelle logarithmique). Le point d’inflexion vers 2005 correspond à l’arrivée des approches NGS (new generation sequencing). Début 2023, le coût revendiqué par Illumina est de deux cents dollars par génome. Source : NHGRI (National Human Genome Research Institute).
Dans le texte

	Figure 2. Du très haut de gamme : le système « DNBSEQ-T10x4RS » proposé par MGI/Complete Genomics, qui rassemble plusieurs appareils servis par un bras robotique et pour lequel l’entreprise revendique une production de 76 térabases (de séquence brute) en une session de quatre jours environ. Extrait du site de MGI-Tech (https://en.mgi-tech.com/products/).
Dans le texte

	Figure 3. Le « séquenceur » d’Oxford Nanopore Technology, une cartouche d’une centaine de grammes qui peut produire de dix à cinquante gigabases de séquence (brute). Il ne lui manque qu’un ordinateur pour être fonctionnel. On appréciera la différence avec le « monstre » de la Figure 2… Extrait du site d’ONT (https://nanoporetech.com/products/specifications).
Dans le texte