Principe de la spectroscopie de corrélation de fluorescence à rayon variable. La spectroscopie FCS (fluorescent correlation spectroscopy) nécessite un montage optique permettant (A) de positionner précisément une source d’illumination confocale (« spot d’illumination »), (B) d’enregistrer les fluctuations de fluorescence produites par la diffusion de molécules fluorescentes à travers ce spot immobile et (C) d’analyser ces fluctuations par une fonction d’autocorrélation G(τ). Cette analyse permet de déterminer le temps moyen de résidence dans le spot d’illumination (ou temps de diffusion τ_d), ainsi que le nombre moyen de particules diffusantes (N). D. En faisant varier expérimentalement la surface d’excitation (de rayon ω1, ω2, ω3, etc.), on peut définir une relation linéaire entre les temps de diffusion mesurés et le carré des rayons du spot d’illumination (ω²) pour des valeurs au-dessus de la limite de diffraction (zone hachurée). La droite coupe l’axe à l’origine (t ₀=0) dans le cas de mouvements browniens (diffusion libre ou pseudo-libre). Une déviation de cette relation est mesurée si la diffusion est restreinte par un maillage (t ₀ <0) ou si les molécules sont transitoirement partitionnées dans des nanodomaines isolés (t ₀ >0).