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Numéro
Med Sci (Paris)
Volume 25, Numéro 10, Octobre 2009
Page(s) 835 - 842
Section M/S revues
DOI https://doi.org/10.1051/medsci/20092510835
Publié en ligne 15 octobre 2009

© 2009 médecine/sciences - Inserm / SRMS

La protéomique quantitative

Généralités

Le domaine de la protéomique - définie comme l’étude de l’ensemble des protéines d’un échantillon biologique donné - s’est développé de façon spectaculaire au cours des dernières années [1, 2]. Les progrès majeurs réalisés dans le domaine de l’instrumentation pour la protéomique (spectrométrie de masse, chromatographie liquide nano-débit), associés à la masse d’informations sans cesse croissante disponible dans les banques de données et à la conception de nouveaux outils logiciels, ont conduit à la mise en place de stratégies qui permettent d’analyser le protéome des échantillons biologiques de manière efficace et fiable. Ainsi, des inventaires de protéines de plus en plus complets ont pu être établis dans le cadre de travaux menés chez l’homme et chez des organismes modèles. Indéniablement, ces inventaires réalisés à partir d’échantillons plus ou moins complexes et ciblés (tissus, cellules, compartiments subcellulaires, complexes protéiques, etc.) ont participé à une meilleure connaissance des acteurs moléculaires impliqués dans les grands « mécanismes du vivant ». Le principe général d’une analyse protéomique est présenté dans la Figure 1 et l’Encadré 1. Les entités analysées par ce type d’approche sont les peptides issus de la digestion enzymatique des protéines.

thumbnail Figure 1.

Déroulement d’une analyse protéomique basée sur la spectrométrie de masse. Une analyse protéomique classique se déroule comme suit : la première étape (à gauche) consiste généralement à fractionner l’échantillon pour le décomplexifier afin de rendre accessible à l’analyse des protéines peu abondantes ou de cibler un complexe protéique. Cette séparation peut être basée sur des méthodes biochimiques (fractionnement subcellulaire, colonnes d’affinité, copurification, etc.) et/ou électrophorétiques (SDS-PAGE ou 2D-GE). Les protéines ainsi séparées sont ensuite digérées par une enzyme protéolytique comme la trypsine. Les peptides générés sont séparés par chromatographie liquide, ionisés, analysés en mode MS afin d’en déduire leur masse (à droite). Les peptides sélectionnés sont fragmentés et analysés en mode MS/MS. Les spectres de fragmentation obtenus sont confrontés avec les spectres MS/MS théoriques obtenus in silico pour chaque peptide trypsique prédit à partir des séquences répertoriées dans une banque de données protéique pertinente. Cette confrontation permet d’identifier la séquence en acides aminés du peptide qui a été fragmenté et, par conséquent, d’identifier la protéine correspondante.

Cependant, le protéome est une entité hautement dynamique. De ce fait, un enjeu majeur pour la protéomique consiste aujourd’hui à développer la protéomique quantitative et les outils et méthodes qui permettront d’appréhender cette nouvelle dimension de l’analyse. Le décryptage systématique des variations d’abondance du protéome en réponse à divers facteurs (hormone, stress, délétion de gène, pathologie, etc.) constitue en effet un moyen puissant pour approfondir notre connaissance des mécanismes cellulaires ou rechercher de nouveaux marqueurs de maladies. Ces techniques présentent un avantage sur les techniques de transcriptomique puisqu’elles s’intéressent aux protéines, les principaux acteurs du vivant et non à leurs précurseurs, les ARNm dont le niveau d’expression n’est pas toujours corrélé à l’abondance des protéines correspondantes.

Les différentes stratégies d’analyse protéomique quantitative

Il existe de plus en plus de méthodes de protéomique quantitative. Elles peuvent être classées en deux groupes : les techniques avec marquage et les techniques sans marquage. Ces différentes stratégies sont décrites dans des articles de revues [3, 4].

  • Les techniques sans marquage

Elles incluent l’électrophorèse 2D (2D-GE) (GE pour gel electrophoresis) [5], la comparaison de traces MS (MS pour spectrométrie de masse) [6] et le spectral count (ou comptage de spectres MS/MS) [7] (Figure 1 et Encadré 1).

La 2D-GE est une méthode très résolutive qui permet de repérer les protéines qui sont différentiellement exprimées entre deux ou plusieurs échantillons. Cependant, cette technique affiche certaines limites : en particulier, elle s’applique très difficilement aux protéines membranaires et aux protéines présentant des points isoélectriques extrêmes. De plus, cette méthode est difficilement adaptable à une stratégie analytique « haut débit » et est limitée à l’étude des protéines les plus abondantes.

Avec le développement de spectromètres de masse couplés à des systèmes de chromatographie liquide, il est devenu possible d’analyser rapidement l’abondance des protéines issues d’échantillons biologiques complexes en comparant directement les intensités de signal de chaque peptide entre différents échantillons. La comparaison de traces MS s’appuie sur la correspondance qui existe entre l’intensité du pic détecté par le spectromètre de masse en mode MS et la quantité de l’espèce correspondant à ce pic MS dans le mélange analysé. D’autre part, le comptage de spectres est une méthode récente qui permet de relier l’abondance d’une protéine au nombre de spectres MS/MS qui ont permis d’identifier cette protéine.

Toutes ces méthodes demandent une parfaite maîtrise et de la rigueur, à la fois dans les étapes de préparation des échantillons en amont et dans le traitement bio-informatique et statistique des données en aval de l’analyse en masse. Elles ont cependant l’avantage de pouvoir être appliquées à tout type d’échantillons biologiques, que ce soit des cellules en culture ou des échantillons cliniques (biopsies, fluides biologiques, etc.), de permettre la comparaison d’un grand nombre d’échantillons et de représenter un faible coût de mise en œuvre.

  • Les techniques de protéomique comparative avec marquage

Elles sont nombreuses et variées. Basée sur la 2D-GE, la technique 2D-DIGE (differential in gel electrophoresis) [8] permet l’analyse sur un même gel de deux échantillons protéiques préalablement marqués avec des fluorophores distincts. Toutefois, aujourd’hui, la majorité des techniques de protéomique quantitative avec marquage s’appuient sur l’utilisation d’isotopes stables pour une analyse différentielle en spectrométrie de masse. Pour comparer deux échantillons, les protéines de l’un sont marquées avec des isotopes lourds (protéines « lourdes ») alors que les protéines du deuxième échantillon sont marquées avec des isotopes légers (protéines « légères »). L’analyse en spectrométrie de masse permet de repérer des paires de peptides lourds et légers dont l’abondance relative peut être calculée. Le marquage isotopique dans les échantillons à étudier peut se faire de différentes manières : marquage métabolique [912], marquage chimique (ICAT ou isotope coded affinity tags, iTRAQ ou isobaric tag for relative and absolute quantification) [1315], marquage enzymatique [16] ou marquage post-enzymatique [17, 18].

Chaque méthode présente ses avantages et ses inconvénients. Toutefois, il est très important d’introduire l’étape de marquage isotopique le plus précocement possible dans le processus de préparation des échantillons. Ceci permet en effet de limiter les erreurs de quantification inéluctables liées à la manipulation en parallèle des échantillons à comparer (Figure 2). Cette étape de marquage précoce peut passer par un marquage métabolique des protéines comme c’est le cas pour le marquage 15N et pour la technique SILAC (stable isotope labelling by amino acids in cell culture).

thumbnail Figure 2.

Stratégies de protéomique quantitative et impact sur la précision de la quantification. Les échantillons à comparer sont représentés en bleu et rouge. La ligne pleine horizontale représente le stade où les échantillons sont combinés. Quand les échantillons sont traités en parallèle (lignes pointillées), des erreurs de quantification non compensées peuvent être introduites. SILAC : stable isotope labelling by amino acids in cell culture ; ICAT : isotope coded affinity tags ; iTRAQ : isobaric tag for relative and absolute quantification (adapté de [3]).

Le traitement informatique des données issues de marquages métaboliques au 15N est délicat car l’écart de masse introduit par le marquage entre un peptide léger et un peptide lourd est fonction du nombre d’azotes présents dans le peptide alors qu’il est fixe dans le cas du SILAC. Ceci rend les données plus faciles à traiter. Ainsi, à l’heure actuelle, la stratégie SILAC est l’une des méthodes de protéomique quantitative les plus fiables et les plus performantes. Ces atouts sont d’ailleurs reflétés par la bibliométrie qui révèle que, comparativement aux autres techniques de protéomique quantitative avec marquage, on a observé au cours des six dernières années un véritable « décollage » du nombre d’articles utilisant le SILAC. D’un seul article en 2002 nous sommes passés à une soixantaine en 2008. Cette supériorité de la technique SILAC est d’autant plus flagrante si l’on compare les facteurs d’impact des journaux dans lesquels ces articles sont publiés.

La stratégie SILAC

Principe

La méthode qui est maintenant connue sous le nom de SILAC avait d’abord été nommée AACT (amino acid coded mass tagging) [10, 11]. Elle s’applique à des cellules maintenues en culture. Récemment, elle a été adaptée au marquage des tissus et organes d’une souris [19]. Le principe est schématisé dans la Figure 3.

thumbnail Figure 3.

Représentation schématique de la stratégie SILAC. Une expérience SILAC se compose de deux phases distinctes : une phase d’adaptation (A) et une phase expérimentale (B). A. Durant la phase d’adaptation, les cellules sont cultivées dans un milieu où certains acides aminés ont été substitués par leurs isotopes « lourds » jusqu’à ce que les cellules aient complètement incorporé les acides aminés marqués (losange rouge sur les graphes et couleur des boîtes). En parallèle, une culture en milieu standard est effectuée. B. Dans la seconde phase, l’expérience en tant que telle, suite à l’incorporation du marquage et à l’application d’un stress ou stimulus à une des populations cellulaires, les lots de cellules à comparer sont mélangés. L’échantillon total ou un sous-protéome est analysé par spectrométrie de masse. Les peptides lourds et légers, qui peuvent être distingués grâce au marquage isotopique différentiel (point bleu versus losange rouge sur les graphes), seront quantifiés en mode MS et identifiés en mode MS/MS (adapté de [3]).

  • La première phase de l’expérience, la phase d’adaptation, consiste à cultiver une population de cellules en présence d’acides aminés isotopiquement alourdis jusqu’à ce que toutes les protéines aient incorporé ces acides aminés lourds dans une proportion comprise entre 95 et 100 %. Il est nécessaire de déterminer expérimentalement ces conditions d’incorporation pour chaque lignée ou type cellulaire. Les paramètres qui orientent le choix des acides aminés marqués sont discutés dans l’Encadré 2. Il a été démontré à plusieurs reprises que les milieux de culture modifiés n’affectaient en rien la croissance, division, morphologie ou réponse biologique des cellules [12, 20]. Généralement, après 6 à 8 temps de doublement de la population cellulaire, toutes les protéines ont incorporé les acides aminés alourdis avec un taux d’incorporation proche de 100 %. Il a récemment été démontré que la méthode SILAC n’était pas restreinte aux cellules qui prolifèrent en culture, mais pouvait être appliquée à des cellules neuronales primaires [21, 22]. Dans le cas de « souris SILAC », le marquage total de toutes les protéines a été obtenu au cours de la deuxième génération de souris nourries avec de la lysine marquée 13C [19].

    Dans toutes les expériences de type SILAC, l’incorporation des acides aminés peut être suivie par spectrométrie de masse en mode MS. Au cours du marquage, pour chaque peptide, le peptide lourd apparaît sur la trace MS séparé du peptide léger par un écart correspondant à la différence de masse entre les acides aminés légers et lourds. L’incorporation est considérée comme totale lorsque les pics correspondant aux peptides légers ne peuvent plus être détectés sur la trace MS. Les protéines lourdes se trouvent alors comme « marquées au fer rouge ».

  • Au cours de la phase expérimentale, après avoir cultivé une population cellulaire dans un milieu normal et l’autre dans un milieu isotopiquement alourdi pendant le temps nécessaire au marquage, un stress ou stimulus peut être appliqué à l’une des populations. Les cellules issues des deux conditions de culture sont alors mélangées dans un rapport 1:1. Les échantillons peuvent ensuite être fractionnés, les protéines digérées et les peptides analysés en MS et MS/MS. L’information concernant l’origine de chaque protéine est conservée grâce à l’écart de masse introduit par le marquage isotopique qui est facilement détectable au moment de l’analyse protéomique. Chaque peptide est donc détecté par le spectromètre de masse sous la forme d’une paire constituée d’une forme lourde et d’une forme légère. L’analyse protéomique comparative consiste alors à repérer les paires sur la trace MS. Pour chaque paire, le rapport des intensités du signal des formes lourdes et légères traduit la différence de concentration de ces peptides dans le mélange analysé. En corrélant données MS et données MS/MS, il est possible de remonter à l’identification des peptides et donc des protéines qui présentent des différences d’abondance entre les échantillons à comparer.

Acquisition, traitement et validation des données de spectrométrie de masse

Il n’existe pas de spectromètre de masse particulièrement dédié à l’analyse des échantillons SILAC. Cependant, les spectromètres de masse de nouvelle génération, qui offrent une grande précision de masse, une haute résolution et une vitesse d’acquisition élevée des données en mode MS/MS, permettent d’identifier et de quantifier un plus grand nombre d’espèces peptidiques.

La partie la plus délicate de la stratégie SILAC consiste à analyser les données informatiques avec des outils dédiés et performants qui (1) détectent les espèces présentes sous forme de paires sur la trace MS, (2) calculent les ratios d’intensité pour chaque paire et (3) font correspondre à chaque paire une séquence obtenue grâce à l’analyse MS/MS. De nombreux outils logiciels ont été développés pour effectuer une ou plusieurs de ces étapes. Deux de ces outils semblent particulièrement prometteurs : MFPaQ [23] et MaxQuant [24]. Ils présentent l’intérêt d’être des logiciels libres (open source). Bien que restreints aux données issues d’un type de configuration instrumentale, ces deux outils se démarquent par leur relative facilité d’utilisation. De ce fait, la technique SILAC pourrait, dans un futur proche, être accessible à un public de plus en plus large. Au vu du nombre de protéines différentiellement exprimées et identifiées, le problème de la validation des résultats se pose pour les résultats d’analyses SILAC, tout comme pour les autres méthodes haut débit, qu’elles soient transcriptomiques ou protéomiques. L’analyse statistique de données issues de ce type d’analyse peut faciliter l’acceptation d’un résultat par la communauté mais ne peut pas remplacer la validation par des méthodes complémentaires qui est indispensable pour confirmer la différence d’expression mesurée.

Applications

La méthode SILAC a été utilisée dans de nombreuses études utilisant divers modèles biologiques dont les applications étaient fondamentales ou cliniques.

  • Dynamique de voies de signalisation cellulaire

    Si les premières études se sont intéressées à la différenciation de cellules souches [12, 25], l’essentiel de la littérature utilisant le SILAC concerne l’étude de la dynamique de voies de signalisation intracellulaires via l’étude de modifications post-traductionnelles, notamment de phosphorylations et de méthylations. Les articles les plus marquants se sont intéressés à l’étude des voies de signalisation activées par l’EGF (epidermal growth factor) dans les cellules mammifères [26, 27] ou par les phéromones chez la levure [28, 29].

  • Reconstitution de réseaux d’interaction

    L’utilisation du SILAC pour étudier les réseaux protéiques est en pleine expansion, comme le reflètent les nombreux articles décrivant cette application. En effet, en réalisant une comparaison entre une expérience de coprécipitation et un contrôle négatif, le SILAC permet de discriminer les vraies interactions et les faux positifs et ainsi d’évaluer la spécificité d’interactions protéiques [3032]. Un autre aspect particulièrement intéressant de cette application est qu’elle permet de distinguer les partenaires labiles des partenaires stables d’un complexe protéique [33] et représente ainsi une stratégie originale et élégante pour aborder la dynamique des complexes protéiques. Récemment, l’utilisation du SILAC pour étudier les partenaires d’interaction a été étendue à l’étude de complexes ADN/protéine [34].

  • Protéomique spatiotemporelle

    Un autre aspect intéressant de la technique SILAC est la possibilité qu’elle offre d’approfondir l’analyse protéomique en étudiant spécifiquement l’évolution du contenu protéique ou le taux de renouvellement des protéines d’un sous-protéome d’intérêt (complexe protéique ou compartiment cellulaire). Bien que d’autres techniques de protéomique quantitative permettent également d’atteindre ce but, la technique SILAC est particulièrement adaptée à ce type d’études fonctionnelles, ne serait-ce que parce qu’elle permet de mélanger les échantillons à comparer à un stade précoce du traitement et ainsi d’éviter des erreurs de quantification dues à la préparation en parallèle des échantillons biologiques. À titre d’exemple on peut citer l’étude de l’effet de l’actinomycine (un inhibiteur de la transcription) sur la dynamique des protéines nucléolaires des cellules Hela [35] et le taux de renouvellement des protéines du CMH (complexe majeur d’histocompatibilité) dans une lignée tumorale ovarienne [36].

  • Identification de biomarqueurs pathologiques

    D’un point de vue clinique, le SILAC est une méthode de choix pour identifier des marqueurs de maladies à partir de lignées cellulaires modèles. Il a par exemple été utilisé avec succès pour identifier des biomarqueurs spécifiques de cellules cancéreuses en comparant lignées de cellules pancréatiques [37] et mammaires [38] normales et tumorales. Le SILAC a également été utilisé pour évaluer des réponses pharmacologiques comme celle déclenchée par l’inhibition du récepteur ERBB2 (ou HER2/neu, human epidermal growth factor receptor 2) dans le traitement de certains cancers du sein [39]. Il est toutefois important de rappeler que l’utilisation du SILAC dans le contexte d’une recherche de biomarqueurs implique l’utilisation de lignées cellulaires modèles réellement pertinentes pour l’étude de la pathologie en question. De plus, nous voudrions insister sur le fait que l’utilisation du SILAC est restreinte à la phase d’identification de ces marqueurs à partir de cellules en culture. En dehors du fait que le SILAC in vivo ne peut être étendu à l’homme, les techniques de protéomique sans marquage sont plus adaptées pour l’identification et surtout pour la validation de biomarqueurs impliquant le criblage de nombreux échantillons cliniques. Le problème de la validation des résultats est d’ailleurs particulièrement sensible pour les projets qui visent à identifier des marqueurs de maladies, quelle que soit la stratégie utilisée. Ainsi, un grand nombre de candidats biomarqueurs ont été identifiés par des techniques de protéomique quantitative mais ces candidats prometteurs n’ont pas trouvé d’application en clinique, par manque de stratégies de validation haut débit [40].

  • Vers des études in vivo

    Une nouvelle étape dans le développement et les applications potentielles du SILAC a récemment été franchie avec l’obtention d’une souris SILAC dont toutes les protéines ont incorporé des isotopes 13C de lysine [19]. Cette étude a permis de déterminer que le marquage n’a aucun effet sur la croissance, la reproduction ou le comportement des souris. En comparant souris knock out et sauvages, les effets de l’inactivation de trois protéines impliquées dans la formation du complexe d’adhésion cellulaire médié par les intégrines ont pu être étudiés. Les auteurs ont ainsi pu identifier des protéines impliquées dans la structure de la membrane plasmique des érythrocytes dont le niveau d’expression est modifié chez la souris en l’absence d’expression de la protéine Kindlin. Ces modifications du protéome sont corrélées avec l’anémie sévère qui caractérise le phénotype observé chez cette souris.

Cette souris est donc un outil extrêmement prometteur pour étudier de manière quantitative les protéomes d’organes et de fluides biologiques et pour déterminer les mécanismes moléculaires liés aux phénotypes observés in vivo.

Conclusion

Bien que le marquage métabolique à l’échelle d’un animal entier en soit encore à ses balbutiements, les nombreuses applications du SILAC permettent de prendre la mesure du potentiel que représente le développement de cette technique. Il est probable que, dans un futur proche, l’approche SILAC soit encore essentiellement utilisée dans le domaine de l’étude des cellules en culture, ne serait-ce que pour des raisons de coût. En effet, les milieux de culture adaptés au marquage SILAC étant déjà relativement onéreux, il est facile d’imaginer le coût extrêmement élevé du marquage d’un animal entier. Malgré cet obstacle, partagé par toutes les méthodes de protéomique quantitative impliquant un marquage isotopique, le SILAC est une méthode de choix pour la réalisation d’analyses quantitatives fiables, robustes et reproductibles.

Le développement d’une nouvelle génération d’outils bio-informatiques plus conviviaux dédiés à l’exploitation des résultats d’expériences SILAC incite à penser que cette technique est amenée à poursuivre son développement et à être de plus en plus largement utilisée. Combinée à des approches traditionnelles de biologie cellulaire et de biochimie, la méthode SILAC est amenée à devenir, dans un futur proche, une stratégie de choix pour aborder l’étude de nombreuses problématiques en biologie.

Conflit d’intérêts

Les auteurs déclarent n’avoir aucun conflit d’intérêts concernant les données publiées dans cet article.

Remerciements

Les auteurs remercient Jérôme Garin et les autres membres du Laboratoire d’Étude de la Dynamique des Protéomes pour leurs commentaires constructifs sur cette revue. Anouk Emadali est bénéficiaire d’un financement post-doctoral INCa ; le travail de Maighread Gallagher-Gambarelli est financé par un contrat Jeunes Chercheurs Inserm.

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  46. Schmidt F, Strozynski M, Salus SS, et al. Rapid determination of amino acid incorporation by stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC). Rapid Commun Mass Spectrom 2007; 21 : 3919–26.
  47. Van Hoof D, Pinkse MW, Oostwaard DW, et al. An experimental correction for arginine-to-proline conversion artifacts in SILAC-based quantitative proteomics. Nat Methods 2007; 4 : 677–8.
  48. Bendall SC, Hughes C, Stewart MH, et al. Prevention of amino acid conversion in SILAC experiments with embryonic stem cells. Mol Cell Proteomics 2008; 7 : 1587–97.
  49. Amanchy R, Kalume DE, Iwahori A, et al. Phosphoproteome analysis of HeLa cells using stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC). J Proteome Res 2005; 4 : 1661–71.

Liste des figures

thumbnail Figure 1.

Déroulement d’une analyse protéomique basée sur la spectrométrie de masse. Une analyse protéomique classique se déroule comme suit : la première étape (à gauche) consiste généralement à fractionner l’échantillon pour le décomplexifier afin de rendre accessible à l’analyse des protéines peu abondantes ou de cibler un complexe protéique. Cette séparation peut être basée sur des méthodes biochimiques (fractionnement subcellulaire, colonnes d’affinité, copurification, etc.) et/ou électrophorétiques (SDS-PAGE ou 2D-GE). Les protéines ainsi séparées sont ensuite digérées par une enzyme protéolytique comme la trypsine. Les peptides générés sont séparés par chromatographie liquide, ionisés, analysés en mode MS afin d’en déduire leur masse (à droite). Les peptides sélectionnés sont fragmentés et analysés en mode MS/MS. Les spectres de fragmentation obtenus sont confrontés avec les spectres MS/MS théoriques obtenus in silico pour chaque peptide trypsique prédit à partir des séquences répertoriées dans une banque de données protéique pertinente. Cette confrontation permet d’identifier la séquence en acides aminés du peptide qui a été fragmenté et, par conséquent, d’identifier la protéine correspondante.

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thumbnail Figure 2.

Stratégies de protéomique quantitative et impact sur la précision de la quantification. Les échantillons à comparer sont représentés en bleu et rouge. La ligne pleine horizontale représente le stade où les échantillons sont combinés. Quand les échantillons sont traités en parallèle (lignes pointillées), des erreurs de quantification non compensées peuvent être introduites. SILAC : stable isotope labelling by amino acids in cell culture ; ICAT : isotope coded affinity tags ; iTRAQ : isobaric tag for relative and absolute quantification (adapté de [3]).

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thumbnail Figure 3.

Représentation schématique de la stratégie SILAC. Une expérience SILAC se compose de deux phases distinctes : une phase d’adaptation (A) et une phase expérimentale (B). A. Durant la phase d’adaptation, les cellules sont cultivées dans un milieu où certains acides aminés ont été substitués par leurs isotopes « lourds » jusqu’à ce que les cellules aient complètement incorporé les acides aminés marqués (losange rouge sur les graphes et couleur des boîtes). En parallèle, une culture en milieu standard est effectuée. B. Dans la seconde phase, l’expérience en tant que telle, suite à l’incorporation du marquage et à l’application d’un stress ou stimulus à une des populations cellulaires, les lots de cellules à comparer sont mélangés. L’échantillon total ou un sous-protéome est analysé par spectrométrie de masse. Les peptides lourds et légers, qui peuvent être distingués grâce au marquage isotopique différentiel (point bleu versus losange rouge sur les graphes), seront quantifiés en mode MS et identifiés en mode MS/MS (adapté de [3]).

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