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Numéro
Med Sci (Paris)
Volume 23, Numéro 12, Décembre 2007
Page(s) 1159 - 1161
Section Repères
DOI https://doi.org/10.1051/medsci/200723121159
Publié en ligne 15 décembre 2007

© 2007 médecine/sciences - Inserm / SRMS

La vaste collection de mutations spontanées ou induites par des agents mutagènes, alimentée par les généticiens de la souris depuis plus de cent ans, a contribué de façon remarquable à la compréhension de la biologie de ce mammifère modèle. Au début des années 1980, la technique de transgenèse par microinjection de zygotes a apporté un changement radical dans les méthodes d’obtention de modifications génétiques chez la souris. Cependant, les problèmes inhérents à cette technique et liés au caractère aléatoire de l’intégration de l’ADN injecté constituaient des limitations importantes pour de nombreuses applications. Les travaux récompensés cette année par le comité Nobel ont, en levant ces difficultés, littéralement révolutionné le domaine de la génétique fonctionnelle des mammifères.

De la tumeur aux cellules souches embryonnaires

Indéniablement, les travaux initiés par Leroy Stevens et Barry Pierce dans les années 1950, portant sur l’étude des tératocarcinomes murins, ont ouvert la voie à l’isolement en culture de cellules souches embryonnaires (en abrégé ES pour embryonic stem). Les tératocarcinomes sont des tumeurs fascinantes de l’ovaire ou du testicule, qui tirent leur nom (du grec teras, teratos, qui signifie monstre) du fait qu’elles contiennent de nombreux types cellulaires différenciés et même parfois des organes (os, dent, cheveux, muscle…) et ressemblent en quelque sorte à des embryons désorganisés et monstrueux. La greffe hors de l’utérus d’un embryon âgé de moins de 8 jours peut, dans certaines conditions, également provoquer l’apparition de tératocarcinomes. En plus des tissus différenciés, ces tumeurs contiennent souvent des cellules indifférenciées appelées cellules de carcinome embryonnaire (en abrégé EC pour embryonal carcinoma), qui ressemblent aux cellules embryonnaires primitives et sont responsables du caractère éventuellement malin de ce type de tumeur. Dans les années 1970, plusieurs équipes dont celle de Martin Evans ont réussi à établir, à partir de tératocarcinomes, des lignées clonales de cellules EC. Ces cellules gardent in vitro leur capacité de différenciation et sont capables, dans certaines conditions, de donner naissance à des dérivés des trois feuillets embryonnaires. De façon spectaculaire, lorsque les cellules de certaines lignées EC sont injectées dans la cavité d’un blastocyste, elles perdent (au moins temporairement) leur caractère tumorigène et participent à une embryogenèse normale (pour revue, voir [1, 2]). Cependant, la grande hétérogénéité et la grande instabilité caryotypique des cellules EC, probablement dues à leur origine tumorale, ont rapidement fait retomber l’enthousiasme initialement soulevé par ces expériences.

Se fondant sur les nombreux points communs entre cellules EC et cellules de la masse cellulaire interne du blastocyste, Martin Evans eut l’idée d’essayer d’isoler des cellules embryonnaires pluripotentielles directement à partir de blastocystes de souris. Fort de son expérience sur l’observation, la manipulation et les propriétés des cellules EC et sur les conditions de culture nécessaires à leur croissance à l’état indifférencié, il réussit avec Matt Kaufman à établir, par co-culture sur cellules nourricières, des cellules indifférenciées présentant de façon stable un caryotype normal et possédant un fort potentiel de différenciation [3]. Une étude similaire réalisée par Gail Martin, une ancienne collaboratrice de Martin Evans, fut publiée la même année [4]. La terminologie ES a été adoptée pour désigner ces cellules, initialement baptisées EK et ESC respectivement. Quelques années plus tard, Martin Evans et ses collègues produisirent, après injection de cellules ES dans la cavité d’un blastocyste, des souris chimères constituées de cellules issues à la fois des cellules du blastocyste hôte et des cellules ES [5]. De façon remarquable, certaines de ces souris présentaient un chimérisme germinal, permettant la transmission du génotype des cellules ES aux générations suivantes. L’étape suivante a été de démontrer que les cellules ES pouvaient être manipulées in vitro sans perdre leur capacité à donner des chimères germinales. Ici encore la contribution de Martin Evans et de ses collaborateurs a été déterminante puisqu’ils réussirent à établir des lignées de souris transgéniques à partir de cellules ES infectées par un rétrovirus recombinant [6]. Avec l’obtention une année plus tard d’une lignée de souris déficiente pour le gène de l’hypoxanthine phosphoribosyl transferase (Hprt) résultant d’un événement de mutation par insertion aléatoire d’ADN rétroviral dans le génome des cellules ES [7], cette expérience laissait entrevoir l’énorme potentiel des cellules ES pour produire des souris génétiquement modifiées.

Modifications délibérées du génome

Les travaux, menés indépendamment par Mario Capecchi et Oliver Smithies au début des années 1980, avaient pour but d’obtenir l’intégration d’un fragment d’ADN à un site chromosomique déterminé, donc en quelque sorte de cibler cette intégration. C’est en analysant l’organisation des concatémères formés par l’intégration de plusieurs copies d’un fragment d’ADN injecté que Mario Capecchi démontra que les cellules de mammifères avaient la capacité d’effectuer la recombinaison entre des séquences d’ADN homologues [8]. Il apparaissait alors que si la machinerie cellulaire assurant cette recombinaison pouvait être détournée et utilisée pour accomplir la recombinaison homologue entre une molécule d’ADN nouvellement introduite dans la cellule et le gène cellulaire résidant correspondant, alors n’importe quel gène pourrait être muté. Encore fallait-il déterminer la nature et l’organisation des séquences présentes sur le vecteur de ciblage et nécessaires à l’événement de recombinaison, mais également trouver les moyens de discriminer ce dernier par rapport aux événements d’intégration aléatoire nettement plus fréquents. Au milieu des années 1980, c’est chose faite : les équipes de Mario Capecchi et d’Oliver Smithies réussissent à cibler par recombinaison homologue, d’une part, la copie mutée d’un gène de sélection préalablement intégrée dans le génome de cellule immortalisée de souris [9] et, d’autre part, le locus de la β-globine d’une cellule tumorale humaine [10].

Une révolution en marche

Tirant profit de leurs travaux sur les cellules immortalisées, Mario Capecchi et Oliver Smithies montrèrent qu’il était possible de cibler le gène hprt des cellules ES, pour créer ou, au contraire pour corriger, des mutations nulles dans celui-ci [1113]. Le gène Hprt a été choisi car des mutations aussi bien perte que gain de fonction pouvaient être directement sélectionnées en culture cellulaire. Avec la mise au point un an plus tard d’une stratégie de sélection baptisée sélection positive-négative, le groupe de Mario Capecchi démontrait que le ciblage, dans les cellules ES, de n’importe quel gène de souris était possible [14]. La publication des premières souris mutantes obtenues par recombinaison homologue dans les cellules ES a lieu en 1989 [1518]. Cette méthodologie s’est ensuite propagée très rapidement dans la communauté des généticiens de la souris et l’on dénombre à ce jour plus de 12 000 lignées de souris (plus de 5 000 gènes ciblés) obtenues par mutagenèse dirigée. Grâce à l’effort de plusieurs consortiums internationaux, des cellules ES mutées pour chacun des gènes de la souris seront prochainement disponibles pour l’ensemble des chercheurs [19]. La technique initiale de ciblage de gène a été, depuis lors, l’objet de multiples variantes ou améliorations. Aujourd’hui, le degré de sophistication est tel que tous les types de modifications génétiques (mutation ponctuelle, délétion, translocation…) peuvent être obtenus et qu’il est possible d’induire une mutation dans un type cellulaire donné et/ou à un moment précis du développement. En un peu moins de vingt ans, les souris mutantes obtenues par ciblage de gènes sont devenues indispensables pour l’étude de quasiment tous les domaines de la biologie et de la physiologie de la souris. Elles ont permis d’étendre de manière spectaculaire notre connaissance de la fonction des gènes et du génome et d’apporter de nouveaux éclairages sur le développement, l’immunologie, la neurobiologie, la physiologie, etc.

Ainsi, c’est la rencontre heureuse entre deux approches indépendantes, cellules ES et recombinaison homologue, qui a abouti à une véritable révolution dans l’approche génétique de la biologie des mammifères. Il faut ajouter, en outre, que la capacité d’engendrer des modifications programmées de la souris a été également mise à profit pour la création de nombreux modèles murins de pathologies humaines. Ces modèles sont indispensables à la recherche biomédicale car ils permettent la dissection expérimentale des maladies, l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques et le développement de nouvelles thérapies.

Remerciements

Je tiens à remercier chaleureusement Charles Babinet pour ses suggestions avisées.

Références

  1. Condamine H. Murine teratocarcinoma: origin and relation to early embryonic cells. Reprod Nutr Dev 1980; 20 : 499–522. (Dans le texte)
  2. Solter D. From teratocarcinomas to embryonic stem cells and beyond: a history of embryonic stem cell research. Nat Rev Genet 2006; 7 : 319–27. (Dans le texte)
  3. Evans MJ, Kaufman MH. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature 1981; 292 : 154–6. (Dans le texte)
  4. Martin GR. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 1981; 78 : 7634–8. (Dans le texte)
  5. Bradley A, Evans M, Kaufman MH, Robertson E. Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines. Nature 1984; 309 : 255–6. (Dans le texte)
  6. Robertson E, Bradley A, Kuehn M, Evans M. Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector. Nature 1986; 323 : 445–8. (Dans le texte)
  7. Kuehn MR, Bradley A, Robertson EJ, Evans MJ. A potential animal model for Lesch-Nyhan syndrome through introduction of HPRT mutations into mice. Nature 1987; 326 : 295–8. (Dans le texte)
  8. Folger KR, Wong EA, Wahl G, Capecchi MR. Patterns of integration of DNA microinjected into cultured mammalian cells: evidence for homologous recombination between injected plasmid DNA molecules. Mol Cell Biol 1982; 2 : 1372–87. (Dans le texte)
  9. Thomas KR, Folger KR, Capecchi MR. High frequency targeting of genes to specific sites in the mammalian genome. Cell 1986; 44 : 419–28. (Dans le texte)
  10. Smithies O, Gregg RG, Boggs SS, et al. Insertion of DNA sequences into the human chromosomal beta-globin locus by homologous recombination. Nature 1985; 317 : 230–4. (Dans le texte)
  11. Doetschman T, Gregg RG, Maeda N, et al. Targetted correction of a mutant HPRT gene in mouse embryonic stem cells. Nature 1987; 330 : 576–8. (Dans le texte)
  12. Doetschman T, Maeda N, Smithies O. Targeted mutation of the Hprt gene in mouse embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 1988; 85 : 8583–7.
  13. Thomas KR, Capecchi MR. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell 1987; 51 : 503–12. (Dans le texte)
  14. Mansour SL, Thomas KR, Capecchi MR. Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo-derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes. Nature 1988; 336 : 348–52. (Dans le texte)
  15. Koller BH, Hagemann LJ, Doetschman T, et al. Germ-line transmission of a planned alteration made in a hypoxanthine phosphoribosyltransferase gene by homologous recombination in embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 1989; 86 : 8927–31. (Dans le texte)
  16. Thomas KR, Capecchi MR. Targeted disruption of the murine int-1 proto-oncogene resulting in severe abnormalities in midbrain and cerebellar development. Nature 1990; 346 : 847–50.
  17. Thompson S, Clarke AR, Pow AM, et al. Germ line transmission and expression of a corrected HPRT gene produced by gene targeting in embryonic stem cells. Cell 1989; 56 : 313–21.
  18. Zijlstra M, Li E, Sajjadi F, et al. Germ-line transmission of a disrupted beta 2-microglobulin gene produced by homologous recombination in embryonic stem cells. Nature 1989; 342 : 435–8. (Dans le texte)
  19. Masson R, Sorg T, Warot X. Génomique fonctionnelle de la souris : la dynamique européenne. Med Sci (Paris) 2007; 23 : 877–80. (Dans le texte)

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