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Numéro
Med Sci (Paris)
Volume 20, Numéro 2, Février 2004
Page(s) 213 - 218
Section M/S revues
DOI https://doi.org/10.1051/medsci/2004202213
Publié en ligne 15 février 2004

© 2004 médecine/sciences - Inserm / SRMS

En première division de méiose, chaque paire de chromosomes homologues est connectée par au moins un événement de recombinaison réciproque, ou crossing-over, visible au microscope sous forme de chiasma. Ces événements d’échanges, produits en prophase, sont essentiels pour la ségrégation réductionnelle des chromosomes homologues : en l’absence de recombinaison méiotique, la ségrégation des chromosomes est en effet altérée, ce qui conduit en général à la formation de gamètes au contenu chromosomique anormal, et donc à une stérilité. Au niveau moléculaire, il a été montré chez Saccharomyces cerevisiae (pour revue, voir [1]) que les événements de recombinaison débutent par la formation de cassures double-brin (CDB) de l’ADN chromosomique. Leur réparation par recombinaison avec le chromosome homologue engendre des conversions géniques, événements non réciproques, et des crossing-over. L’étape de cassure est déterminante, puisqu’elle provoque une lésion dans l’ADN (ce qui peut être dangereux pour la cellule) et qu’elle conditionne la fréquence et la distribution des événements de recombinaison. Elle est sous la dépendance de plusieurs gènes dont la fonction est dans la plupart des cas encore inconnue. En 1997, la fonction de l’un d’entre eux a été identifiée : il s’agit du gène codant pour la protéine Spo11, dont la fonction proposée est de catalyser la formation de ces CDB.

Spo11 : un mutant de sporulation chez S. cerevisiae déficient pour le déclenchement de la recombinaison méiotique

Spo11, un mutant de S. cerevisiae isolé en 1969, est caractérisé par une anomalie de la méiose qui conduit à la formation de spores non viables [2]. Dans les mutants nuls spo11∆ (délétion du gène), aucune cassure double-brin méiotique n’est détectée [3], d’où une absence de recombinaison qui a pour conséquences une ségrégation aléatoire des chromosomes à la première division et un contenu chromosomique anormal dans la majorité des spores. À ce stade, un rôle aussi bien direct qu’indirect pouvait être envisagé pour Spo11 dans l’étape de formation des CDB.

La fonction de Spo11 révélée par les archaebactéries

Chez S. cerevisiae, des analyses moléculaires ont montré que - en présence de la mutation rad50S qui bloque la réparation des cassures [4] - les extrémités 5’ des CDB sont associées de manière covalente avec une protéine. Cette observation a conduit à la proposition que ces cassures soient produites par une des protéines connues pour former des liaisons covalentes avec l’ADN comme les topo-isomérases [57].

En 1997, une homologie a été identifiée entre la sous-unité catalytique (A) d’une famille de topo-isomérases de type II nouvellement découverte chez les archaebactéries, appelée TopoVI [8], et la protéine Spo11. Or, les topo-isomérases de ce type produisent transitoirement des CDB et restent attachées de façon covalente aux extrémités de ces cassures, celles-ci étant ensuite à nouveau attachées par l’enzyme elle-même. Spo11 est donc apparue comme protéine candidate pour l’activité de formation des CDB méiotiques. L’implication directe de Spo11 dans la catalyse des CDB a par la suite été confirmée par deux approches. D’une part, la coupure d’un brin d’ADN implique la présence dans toutes les topo-isomérases d’une tyrosine, appelée tyrosine catalytique ; or, une souche de S. cerevisiae portant la mutation spo11Y135F (changement de la tyrosine 135 en phénylalanine) à l’état homozygote ne forme pas de CDB méiotiques [8]. D’autre part, Spo11 est effectivement associée de manière covalente aux extrémités 5’ des CDB méiotiques in vivo [9].

Un modèle d’action de Spo11 peut être proposé sur la base des données structurales de l’homologue de Spo11 chez l’archaebactérie Methanococcus jannashii [10] et de la conservation structurelle entre cette TopoVIA et la protéine Spo11 de S. cerevisiae (B. de Massy et J.P. Pin, données non publiées) (Figure 1). Selon ce modèle, Spo11 n’aurait pas, contrairement aux topo-isomérases, les propriétés nécessaires pour attacher de nouveau les CDB.

thumbnail Figure 1.

Déclenchement de la recombinaison méiotique par formation de cassures double-brin (CDB) catalysée par Spo11. Le domaine carboxy-terminal Toprim (commun aux topo-isomérases et aux primases) de chaque monomère de Spo11 interagit avec le domaine 5Y-CAP (catabolite gene activator protein) de l’autre monomère. Un dimère se fixe sur l’ADN, introduit une cassure double-brin par l’intermédiaire des tyrosines catalytiques (Y) situées dans les domaines 5Y-CAP et forme deux intermédiaires covalents avec les deux extrémités 5’ d’ADN. À ce stade, les monomères peuvent rester associés ou se séparer. Spo11 se dissocie ensuite de l’ADN selon un mécanisme non encore identifié, qui pourrait impliquer soit une réaction d’hydrolyse de la liaison phosphodiester, soit une coupure simple brin en 3’ du complexe Spo11-ADN. Les cassures double-brin ainsi formées sont ensuite réparées par recombinaison avec le chromosome homologue.

Conservation de Spo11 chez les eucaryotes

Des homologues de TopoVIA et Spo11 sont, respectivement, présents chez toutes les archaebactéries et tous les eucaryotes testés (pour revue, voir [11, 12]). L’analyse des mutants des gènes correspondant à ces homologues a été réalisée par des méthodes différentes selon les organismes étudiés : test de fertilité, analyse cellulaire de la différenciation, analyse cytologique, ou encore analyse génétique et moléculaire de la recombinaison (Tableau I). Les résultats révèlent plusieurs caractéristiques communes aux différentes espèces étudiées [1319, 20]. La fertilité est réduite ou nulle chez tous les mutants spo11 (délétion ou interruption du gène). Dans les espèces où l’on peut évaluer la fréquence de recombinaison chez des organismes stériles ou à fertilité réduite, une absence totale de recombinaison méiotique est observée. Chez Mus musculus, où une telle approche n’est pas réalisable, le test est celui de la formation des chiasmas. Celle-ci est absente chez toutes les espèces où elle a été recherchée (M. musculus, Caenorhabditis elegans, Arabidopsis thaliana et Sordaria macrospora). L’ensemble de ces observations montre que la majorité, si ce n’est la totalité, des événements de recombinaison méiotique est sous le contrôle de Spo11. Enfin, la recherche directe du rôle de Spo11 dans le déclenchement de la recombinaison n’a pour l’instant été réalisée que chez S. cerevisiae et S. pombe, des organismes chez lesquels cette étape est effectivement analysable par détection moléculaire des CDB en méiose : aucune CDB ne peut être détectée en l’absence de Spo11 [3, 15].

Tableau I.

Phénotype des mutants spo11. CDB : cassure double-brin ; nt : non testé(e) ; 1 : les différences de fertilité peuvent s’expliquer par celles du nombre de chromosomes ; 2 : pas de complexe synaptonémal chez S. pombe. Par exemple, chez S. cerevisiae, qui possède seize paires de chromosomes, la probabilité de former un gamète euploïde par ségrégation aléatoire est considérablement plus faible que pour S. pombe, qui n’a que trois paires de chromosomes.

Les mutations de Spo11 n’ont toutefois pas toujours des conséquences identiques pour toutes les espèces : ainsi en est-il des altérations observées dans l’appariement des chromosomes et la progression du cycle méiotique. L’appariement des chromosomes est caractérisé en prophase par la formation d’une structure protéique nommée complexe synaptonémal (pour la souris, en particulier, voir [21]). Plusieurs études suggèrent que les étapes de déclenchement de la recombinaison ont lieu avant la formation de ce complexe [22]. D’ailleurs, celle-ci n’est pas assurée dans les mutants spo11 de S. cerevisiae, S. macrospora, Coprinus cinereus et M. musculus (Figure 2), suggérant que le déclenchement de la recombinaison est requis pour l’assemblage du complexe synaptonémal. En revanche, dans d’autres modèles comme C. elegans ou Drosophila melanogaster, le complexe synaptonémal se forme normalement [16, 23], ce qui suggère l’existence, au moins chez ces organismes, d’un mécanisme d’appariement des chromosomes indépendant de la recombinaison.

thumbnail Figure 2.

Analyse de l’appariement des chromosomes dans des ovocytes de souris. Les protéines Sycp3 (synaptonemal complex protein 3) (en rouge) et Sycp1 (synaptonemal complex protein 1) (en vert) marquent respectivement les axes des chromosomes et les régions appariées dans le complexe synaptonémal. La superposition de ces deux marquages produit un signal jaune. Les centromères situés à l’extrémité de chacun des chromosomes sont également repérés (en rouge) par des anticorps anticentromères (provenant du sérum de sujets présentant un syndrome Crest - calcinose, Raynaud, œsophage, sclérodactylie, télangiectasies). À gauche, dans une lignée sauvage, les 20 paires de chromosomes homologues sont appariées. À droite, chez un mutant Spo11−/−, les axes des 40 chromosomes sont formés, mais les chromosomes ne sont pas appariés (la tache verte est un artéfact).

L’absence de recombinaison a également des conséquences très différentes sur le déroulement du cycle méiotique selon les espèces. Ainsi, chez S. cerevisiae, S. macrospora, S. pombe, A. thaliana, C. elegans ou D. melanogaster, les divisions méiotiques se poursuivent malgré le dysfonctionnement de la ségrégation réductionnelle. En revanche, chez C. cinereus et M. musculus, le cycle méiotique est interrompu en prophase et les cellules méiotiques entrent en apoptose. Il est intéressant de remarquer qu’au sein même de l’espèce M. musculus, les réponses du cycle cellulaire et d’induction d’apoptose diffèrent entre les méioses mâle et femelle.

Questions encore sans réponse

Quel rôle pour les partenaires de Spo11 ?

Bien que le modèle actuel du rôle direct de Spo11 dans le déclenchement de la recombinaison par formation de CDB explique de manière assez satisfaisante plusieurs aspects de la recombinaison méiotique, l’activité enzymatique de Spo11 n’a pas encore été démontrée in vitro. À l’image de son homologue chez les archaebactéries, composé de la sous-unité catalytique TopoVIA et d’une autre sous-unité, TopoVIB, qui contient un site de fixation de l’ATP nécessaire à l’activité de coupure de l’ADN [24], l’activité de Spo11 pourrait nécessiter la présence d’une autre protéine. Or, aucune protéine homologue à TopoVIB n’a été identifiée chez les eucaryotes : il est possible que Spo11 ait évolué de manière à ne plus nécessiter une seconde sous-unité pour son activité catalytique, ou que les propriétés de l’éventuelle seconde sous-unité diffèrent de celles de TopoVIB.

Une situation qui reste exceptionnelle a été décrite chez A. thaliana : son génome possède trois homologues de Spo11, et il est le seul eucaryote connu à ce jour pour posséder un homologue identifié de la sous-unité TopoVIB. Un des homologues de Spo11, exprimé spécifiquement dans les tissus floraux, est requis pour la recombinaison méiotique, suggérant qu’il s’agit là de l’homologue fonctionnel de Spo11 [17]. Les deux autres sont exprimés dans les tissus végétatifs et interagissent tous deux avec l’homologue de TopoVIB : ils pourraient donc avoir avec cette dernière une activité de topo- isomérase [25]. Cette situation suggère une corrélation entre la différenciation des fonctions TopoVI et Spo11 et la présence ou l’absence de la sous-unité B.

Malgré l’absence d’homologue de TopoVIB identifié, l’activité de Spo11 semble nécessiter la présence de partenaires dont le rôle reste à définir : en effet, chez S. cerevisiae, pas moins de dix gènes, outre SPO11, sont nécessaires à la formation des CDB (pour revue, voir [11]). Certaines de ces protéines interagissent d’ailleurs avec Spo11 : Rec102 et Spo11 ont ainsi été co-immunoprécipités au sein d’un même complexe [26], et une interaction entre Ski8 et Spo11 a été mise en évidence par la méthode du double hybride [27]. En revanche, aucun partenaire de Spo11 n’a pu être identifié chez les autres eucaryotes.

Comment les cibles de Spo11 sont-elles choisies ?

Bien que les CDB méiotiques soient localisées dans des régions précises, aucune spécificité de séquence n’a encore été mise en évidence. Toutefois, des études menées chez la levure montrent que les cibles de Spo11 correspondent à certaines régions accessibles de la chromatine (pour revue, voir [28]) dont les spécificités ne sont pas connues. A. Peciña et al. [29] ont étudié les propriétés de la protéine de fusion Gal4-Spo11, Gal4 portant un domaine de reconnaissance et de fixation à une séquence spécifique de l’ADN. Cette protéine chimérique permet la formation de CDB ciblées vers de nouveaux sites : les motifs de fixation de Gal4. Cependant, les dix autres gènes nécessaires à la formation des CDB méiotiques restent tous indispensables à la formation de CDB à ces nouveaux sites. Ces expériences démontrent que ces gènes jouent un rôle essentiel pour l’activité de Spo11, indépendamment du contrôle du choix de la cible [29].

Que fait Spo11 avant et après la formation des CDB ?

La phase de réplication préméiotique se déroule juste avant le début de la prophase. Deux analyses chez S. cerevisiae ont mis en évidence une relation entre cette phase S et le début de la recombinaison. D’une part, il a été montré qu’un intervalle de temps constant sépare la réplication de la formation des CDB, qui intervient par conséquent plus tôt dans les régions répliquées précocement que dans les régions répliquées tardivement [30]. D’autre part, la phase S est raccourcie chez le mutant spo11∆. Bien qu’encore inexpliquées, ces observations suggèrent que certains éléments impliqués dans le déclenchement de la recombinaison, et peut-être Spo11 elle-même, sont mis en place dès la réplication préméiotique [31].

Par ailleurs, un rôle tardif de Spo11, postérieur à la formation des CDB, a été suggéré. La localisation de Spo11 par immunocytochimie chez M. musculus et S. macrospora met en évidence des foyers au stade leptotène, stade auquel les CDB sont détectées chez la levure. De plus, au stade pachytène, alors que les étapes de déclenchement de la recombinaison sont en principe passées, Spo11 est détectée le long des axes des chromosomes appariés [32]. L’ensemble de ces résultats, s’ils n’apportent pas de réponse claire, reflètent sans doute une régulation complexe de la protéine Spo11 avant et après son activité de formation de CDB.

Conclusions

L’étude des caractéristiques de la protéine Spo11 dans différentes espèces révèle une conservation du mécanisme de déclenchement de la recombinaison méiotique par formation de cassures double-brin, qui devra toutefois être confirmée par la mise en évidence des propriétés de coupures de l’ADN de la protéine Spo11 in vitro, et par la mise en évidence de CDB méiotiques chez les eucaryotes supérieurs. Compte tenu du danger potentiel que peut constituer l’activité de Spo11 dans une cellule, un aspect tout à fait fascinant et encore à explorer est celui de sa régulation : comment Spo11 est-elle activée, dirigée vers ses cibles et par la suite inactivée ? Un dérèglement pourrait en effet avoir des conséquences délétères non seulement sur le déroulement de la méiose, mais également dans les cellules somatiques. En effet, même si le gène SPO11 n’est normalement exprimé qu’en méiose (l’analyse génétique des mutants spo11 n’a d’ailleurs permis de déceler aucun phénotype somatique jusqu’à ce jour), on peut imaginer les conséquences sur la stabilité du génome d’une expression inappropriée de SPO11 dans les cellules végétatives.

Références

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Liste des tableaux

Tableau I.

Phénotype des mutants spo11. CDB : cassure double-brin ; nt : non testé(e) ; 1 : les différences de fertilité peuvent s’expliquer par celles du nombre de chromosomes ; 2 : pas de complexe synaptonémal chez S. pombe. Par exemple, chez S. cerevisiae, qui possède seize paires de chromosomes, la probabilité de former un gamète euploïde par ségrégation aléatoire est considérablement plus faible que pour S. pombe, qui n’a que trois paires de chromosomes.

Liste des figures

thumbnail Figure 1.

Déclenchement de la recombinaison méiotique par formation de cassures double-brin (CDB) catalysée par Spo11. Le domaine carboxy-terminal Toprim (commun aux topo-isomérases et aux primases) de chaque monomère de Spo11 interagit avec le domaine 5Y-CAP (catabolite gene activator protein) de l’autre monomère. Un dimère se fixe sur l’ADN, introduit une cassure double-brin par l’intermédiaire des tyrosines catalytiques (Y) situées dans les domaines 5Y-CAP et forme deux intermédiaires covalents avec les deux extrémités 5’ d’ADN. À ce stade, les monomères peuvent rester associés ou se séparer. Spo11 se dissocie ensuite de l’ADN selon un mécanisme non encore identifié, qui pourrait impliquer soit une réaction d’hydrolyse de la liaison phosphodiester, soit une coupure simple brin en 3’ du complexe Spo11-ADN. Les cassures double-brin ainsi formées sont ensuite réparées par recombinaison avec le chromosome homologue.

Dans le texte
thumbnail Figure 2.

Analyse de l’appariement des chromosomes dans des ovocytes de souris. Les protéines Sycp3 (synaptonemal complex protein 3) (en rouge) et Sycp1 (synaptonemal complex protein 1) (en vert) marquent respectivement les axes des chromosomes et les régions appariées dans le complexe synaptonémal. La superposition de ces deux marquages produit un signal jaune. Les centromères situés à l’extrémité de chacun des chromosomes sont également repérés (en rouge) par des anticorps anticentromères (provenant du sérum de sujets présentant un syndrome Crest - calcinose, Raynaud, œsophage, sclérodactylie, télangiectasies). À gauche, dans une lignée sauvage, les 20 paires de chromosomes homologues sont appariées. À droite, chez un mutant Spo11−/−, les axes des 40 chromosomes sont formés, mais les chromosomes ne sont pas appariés (la tache verte est un artéfact).

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