Principes de microscopie multiphotonique. A. Schématisation des niveaux d’énergie d’une molécule fluorescente. La flèche bleue représente l’absorption à un photon (1p), les flèches rouges représentent l’absorption à 2 photons (2p) et les grises représentent l’absorption à 3 photons (3p). La flèche pointillée représente le passage vers un niveau d’énergie intermédiaire avant l’émission spontanée d’un photon de fluorescence (flèche verte). B. Schéma expérimental du montage de la M2P conventionnelle. La source d’excitation est dirigée vers l’échantillon via un système de balayage et un miroir dichroïque, puis elle est concentrée au point focal d’excitation par l’objectif. La fluorescence émise par l’échantillon est ensuite collectée par le même objectif, filtrée par un filtre d’émission et détectée par un tube photomultiplicateur (PMT). Le volume d’excitation doit être éclairé pendant un certain temps (appelé pixel dwell time) afin que l’on puisse récolter assez de photons de fluorescence pour produire un signal clair.