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Numéro
Med Sci (Paris)
Volume 29, Numéro 11, Novembre 2013
Page(s) 1055 - 1058
Section Prix Nobel 2013
DOI https://doi.org/10.1051/medsci/20112713024
Publié en ligne 20 novembre 2013

© 2013 médecine/sciences – Inserm

Vignette (Photo © Inserm - Kathleen Zylbersztejn).

La cellule eucaryote est délimitée par une bicouche lipidique, la membrane plasmique, et composée de différents compartiments membranaires intracellulaires. Pour maintenir cette organisation et conserver l’intégrité structurelle et fonctionnelle des différents compartiments, la cellule se repose sur un ensemble d’événements de trafic membranaire dont les véhicules sont des vésicules lipidiques. Les échanges de matière et d’information assurés par le trafic vésiculaire sont essentiels à la vie cellulaire eucaryote puisqu’ils permettent aux compartiments de communiquer les uns avec les autres mais également à la cellule de communiquer avec son milieu extérieur. En perpétuel remaniement, les compartiments membranaires apparaissent stables grâce à un équilibre dynamique entre flux entrants et sortants, et présentent un état stationnaire de non-équilibre fluctuant typique des systèmes vivants [1]. Le prix Nobel de Médecine ou Physiologie 2013 récompense Randy Schekman, James Rothman et Thomas Südhof, trois chercheurs ayant apporté des contributions majeures à la compréhension des mécanismes moléculaires du transport vésiculaire intracellulaire (Figure 1). Il se situe dans la droite ligne du prix Nobel de 1974 attribué à Albert Claud, Christian de Duve et George Palade pour leur découverte de la compartimentation cellulaire en structures membranaires et de la vectorialité du trafic des protéines de sécrétion qui partent du réticulum endoplasmique, passent par l’appareil de Golgi, puis sont stockées dans des vésicules de sécrétion, qui les acheminent vers la membrane plasmique.

thumbnail Figure 1.

Les découvertes de J. Rothman, R. Schekman et T. Südhof ont permis d’élucider les mécanismes moléculaires qui orchestrent le trafic vésiculaire. Une vésicule de transport fusionne avec une membrane cible lorsque la protéine v-SNARE de la vésicule s’assemble avec sa partenaire t-SNARE de la membrane cible. Dans le cas des événements de fusion dépendants du calcium (par exemple la neurotransmission), la fusion est déclenchée lorsque la protéine Synaptotagmine lie le calcium entraînant une série d’interactions avec les SNAREs et les membranes, qui conduisent à la fusion.

Des acteurs moléculaires conservés

R. Schekman et ses collègues ont choisi une approche génétique pour identifier les acteurs moléculaires clefs du trafic vésiculaire en utilisant comme modèle la levure Saccharomyces cerevisiae. Ils ont profité du fait que des levures mutantes présentant des défauts de sécrétion accumulent des protéines et des lipides nouvellement synthétisés tandis que leur membrane plasmique cesse de croître, induisant ainsi une augmentation de la densité cellulaire. Cela leur a permis d’isoler simplement, par centrifugation, les levures mutantes denses (donc avec des défauts de sécrétion et de croissance) puis d’identifier les gènes impliqués. Cette approche a conduit à l’identification de 23 produits de gènes, appelés Sec1-23, et impliqués dans différentes étapes de la voie de sécrétion [2]. Les mutants Sec17 et Sec18 présentaient notamment un « embouteillage vésiculair », suggérant un rôle dans la fusion membranaire [3]. J. Rothman et ses collègues ont utilisé le fait que les protéines subissent des glycosylations bien spécifiques le long de la voie de sécrétion, permettant ainsi de suivre leur localisation, pour reconstituer in vitro le transport intra-Golgi à partir d’extraits de cellules mammifères. Cette approche biochimique a conduit à la découverte de nombreuses molécules essentielles au trafic membranaire. La première molécule identifiée a été appelée NSF (pour N-ethylmaleimide sensitive factor) car elle était sensible à un agent alkylant, le N-éthylmaléimide. Or, il s’est avéré que NSF était l’homologue mammifère du produit du gène Sec18 identifié dans le crible de R. Schekman [4], mettant ainsi en évidence une convergence majeure entre les travaux des deux chercheurs. Cette convergence avait une implication fondamentale car elle indiquait la conservation des acteurs moléculaires du trafic membranaire de la levure aux mammifères. J. Rothman et ses collaborateurs ont alors déroulé la pelote avec NSF comme point de départ, et ont ensuite identifié la protéine a-SNAP (soluble NSF attachment protein) qui permet la liaison de NSF aux membranes golgiennes. Ils ont de plus montré que le cytosol du mutant Sec17 ne permettait pas la liaison de NSF ni le transport vésiculaire, et que ces défauts pouvaient être compensés par l’ajout de a-SNAP purifiée, suggérant ainsi l’équivalence fonctionnelle entre Sec17 et a-SNAP [5]. Comme NSF et SNAP étaient impliqués dans toutes les étapes de la voie de sécrétion, d’autres facteurs devaient permettre aux vésicules d’atteindre la bonne membrane cible et fusionner. R. Schekman et J. Rothman émirent alors l’hypothèse selon laquelle SNAP et NSF faisaient partie d’un complexe multi-protéique membranaire dont les sous-unités apportant la spécificité aux événements de fusion devaient être identifiées [6].

L’hypothèse SNARE

J. Rothman et ses collaborateurs ont alors pensé que les protéines de ce complexe seraient d’autant plus abondantes, et donc faciles à pêcher, que le trafic vésiculaire est actif ; ils se sont donc tournés vers le système nerveux. En utilisant SNAP et NSF comme appât, ils ont isolés trois protéines à partir d’un extrait de cerveau bovin, qu’ils ont appelées SNARE (pour SNAP receptors) [7]. Ces trois protéines avaient déjà été identifiées, entre autres par De Camilli, Jahn, Scheller et Südhof, comme des protéines abondantes de la terminaison présynaptique : Synaptobrevine 2/VAMP2, Syntaxine 1 et SNAP-25 [810], mais leur fonction exacte était inconnue. Comme Synaptobrevine est localisée dans les vésicules synaptiques, tandis que Syntaxine réside dans la membrane plasmique présynaptique, J. Rothman a proposé la fameuse « hypothèse SNARE » selon laquelle une vésicule de transport s’accroche et fusionne avec une membrane cible lorsqu’une protéine v-SNARE de la vésicule interagit avec une protéine t-SNARE de la membrane cible (target) (Figure 1). Cet article reste un cas très particulier dans l’histoire récente des publications en « article » à Nature puisqu’il a pour donnée principale le puits d’un gel d’électrophorèse coloré au bleu de Coomassie avec identification des protéines visualisées. Un rôle essentiel des SNARE dans la libération des neurotransmetteurs a été proposé à peu près au même moment par De Camilli, Jahn, Montecucco, Niemann et Südhof suite à la caractérisation du mécanisme moléculaire d’action des neurotoxines produites par les bactéries Clostridium botulinum et tetani : ces neurotoxines inhibent la transmission synaptique en clivant les protéines Synaptobrevine, SNAP-25 ou Syntaxine [1113]. Le principe a ensuite été généralisé à la sécrétion des cellules non neuronales [14] et à tous les phénomènes de transport entre compartiments membranaires des cellules eucaryotes [15]. Chaque événement de fusion intracellulaire impliquerait donc une paire originale v-SNARE/t-SNARE dont l’assemblage donnerait la spécificité de l’amarrage de la vésicule à la membrane cible. Les prédictions formulées en 1993 ne sont pas valables dans tous les détails, notamment concernant la spécificité des combinaisons v-SNARE/t-SNARE, mais l’hypothèse émise par J. Rothman a fourni un cadre conceptuel qui a stimulé et guidé vingt ans de recherche visant à comprendre les mécanismes moléculaires du trafic membranaire [16, 17]. Les protéines SNARE sont en effet nécessaires et suffisantes pour fusionner des membranes artificielles in vitro [18] et des cellules modifiées exprimant des t-SNARE ou des v-SNARE sur leur membrane plasmique [19]. Elles s’assemblent à l’image d’une fermeture Éclair et fournissent l’énergie requise pour fusionner les bicouches lipidiques [2022]. Enfin, dans des mutants de Synaptobrevine ou SNAP-25 chez le nématode, la mouche ou la souris, la transmission synaptique est massivement abrogée [2326].

Une mécanique bien huilée

J. Rothman et R. Schekman ont donc identifié les acteurs moléculaires clés et les mécanismes fondamentaux du transport et de la fusion vésiculaire. Cependant, il manquait des éléments essentiels au tableau, notamment pour rendre compte de la sensibilité au calcium de la fusion des vésicules synaptiques qui leur permet de libérer les neurotransmetteurs au bon moment et en un temps record (inférieur à la milliseconde). T. Sudhöf et ses collaborateurs ont identifié deux protéines de la régulation temporelle de la machinerie de fusion membranaire SNARE : Synaptotagmine et Complexine. Synaptotagmine lie les membranes et le complexe SNARE de manière dépendante du calcium, avec une faible affinité pour cet ion. Cela apparaît essentiel dans la démonstration du rôle de Synaptotagmine comme senseur du calcium intracellulaire car une concentration très élevée en calcium, telle qu’on peut la mesurer à proximité immédiate des canaux calcium dépendants du voltage, entraîne la libération des neurotransmetteurs. Dans une expérience très élégante, T. Südhof a généré une souris dont la Synaptotagmine a une affinité altérée pour le calcium entraînant une transmission synaptique moins dépendante du calcium [27]. Les travaux de T. Sudhöf et J. Rothman ont montré que Complexine lie le complexe SNARE et arrête la réaction dans un état proche de la fusion, qui n’attend plus que l’entrée du calcium dans la terminaison nerveuse (et sa liaison à Synaptotagmine) pour redémarrer à une vitesse fulgurante (Figure 1), rendant ainsi compte de l’extrême précision et rapidité de la transmission synaptique in vivo [2830]. Complexine et Synaptotagmine constitueraient donc respectivement le frein et l’accélérateur de la machinerie de fusion synaptique. T. Südhof et ses collaborateurs ont appliqué une approche systématique d’identification des protéines impliquées dans la physiologie de la synapse neuronale, et de caractérisation de leur fonction dans des mutants d’invalidation du gène chez la souris. On peut également citer les travaux sur Munc18-1, une protéine mammifère homologue de la protéine de levure Sec1 (la première identifiée dans le test de Schekman) dont la suppression chez la souris conduit à une perte totale de neurotransmission [31]. Il se trouve que Munc18-1 est un régulateur essentiel de l’activité de la molécule Syntaxine 1 [32] et des travaux récents de J. Rothman ont montré que Munc18-1 stimule exclusivement la fusion induite par le complexe v-SNARE/t-SNARE synaptique, contribuant ainsi à la régulation spatiale des événements de fusion [33]. Les connaissances actuelles du mode d’action de ces différentes protéines qui règlent les rouages de la machinerie SNARE sont présentées dans une revue que Südhof a récemment co-écrite avec Rothman [34]. L’approche incroyablement productive de T. Südhof a généré des modèles expérimentaux utilisés par de nombreuses équipes de recherche pour comprendre le rôle des protéines synaptiques et la fonction des phénomènes sécrétoires notamment au cours du développement [3537].

La boucle est ainsi bouclée, de Sec1 chez la levure à son homologue Munc18-1 chez l’homme. L’importance biomédicale des travaux récompensés par le prix Nobel 2013 est presque secondaire par rapport aux avancées conceptuelles que R. Schekman, J. Rothman et T. Sudhöf ont réalisées quarante ans après le prix Nobel de Claude, de Duve et Palade. Leurs découvertes des acteurs et des mécanismes moléculaires de la fusion membranaire sont pertinentes pour des organismes aussi distants que l’homme et la levure, et s’appliquent à de nombreux phénomènes physiologiques fondamentaux comme le transport des molécules au sein des cellules, la communication neuronale, la sécrétion hormonale et la réponse immunitaire. Le système immunitaire apparaît particulièrement sensible aux perturbations du trafic vésiculaire comme le montrent les mutations des gènes SNARE ou MUNC18 chez des patients immunodéficients et des souris mutantes [3842]. Une nouvelle page s’ouvre maintenant. L’utilisation d’approches multidisciplinaires et intégrées combinant la génétique, la physiologie, la biologie cellulaire et la biophysique devrait encore permettre des avancées majeures pour comprendre le détail fin des mécanismes moléculaires du trafic vésiculaire et l’incroyable dynamique qui parcourt à chaque instant nos cellules.

Liens d’intérêt

Les auteurs déclarent n’avoir aucun lien d’intérêt concernant les données publiées dans cet article.

Références

  1. Prigogine I.. La thermodynamique de la vie. La Recherche 2000 ; 99 : 38. [Google Scholar]
  2. Novick P, Field C, Schekman R. Identification of 23 complementation groups required for post-translational events in the yeast secretory pathway. Cell 1980 ; 21 : 205–215. [CrossRef] [PubMed] [Google Scholar]
  3. Kaiser CA, Schekman R.. Distinct sets of SEC genes govern transport vesicle formation and fusion early in the secretory pathway. Cell 1990 ; 61 : 723–733. [CrossRef] [PubMed] [Google Scholar]
  4. Wilson DW, Wilcox CA, Flynn GC, et al. A fusion protein required for vesicle-mediated transport in both mammalian cells and yeast. Nature 1989 ; 339 : 355–359. [CrossRef] [PubMed] [Google Scholar]
  5. Clary DO, Griff IC, Rothman JE. SNAPs, a family of NSF attachment proteins involved in intracellular membrane fusion in animals and yeast. Cell 1990 ; 61 : 709–721. [CrossRef] [PubMed] [Google Scholar]
  6. Griff IC, Schekman R, Rothman JE, Kaiser CA. The yeast SEC17 gene product is functionally equivalent to mammalian α-SNAP protein. J Cell Biol 1992 ; 267 : 12106–12115. [Google Scholar]
  7. Söllner T, Whiteheart SW, Brunner M, et al. SNAP receptors implicated in vesicle targeting and fusion. Nature 1993 ; 362 : 318–324. [CrossRef] [PubMed] [Google Scholar]
  8. Baumert M, Maycox PR, Navone F, et al. Synaptobrevin: an integral membrane protein of 18, 000 daltons present in small synaptic vesicle of rat brain. EMBO J 1989 ; 8 : 379–384. [PubMed] [Google Scholar]
  9. Bennett MK, Calakos N, Scheller RH.. Syntaxin: a synaptic protein implicated in docking of synaptic vesicles at presynaptic active zones. Science 1992 ; 257 : 255–259. [CrossRef] [PubMed] [Google Scholar]
  10. Oyler GA, Polli JW, Higgins GA, et al. Distribution and expression of SNAP-25 immunoreactivity in rat brain, rat PC-12 cells and human SMS-KCNR neuroblastoma cells. Dev Brain Res 1992 ; 65 : 133–146. [CrossRef] [Google Scholar]
  11. Schiavo G, Benfenati F, Poulain B, et al. Tetanus and botulinum-B neurotoxins block neurotransmitter release by proteolytic cleavage of synaptobrevin. Nature 1992 ; 359 : 832–835. [CrossRef] [PubMed] [Google Scholar]
  12. Blasi J, Chapman ER, Link E, et al. Botulinum neurotoxin A selectively cleaves the synaptic protein SNAP-25. Nature 1993 ; 365 : 160–163. [CrossRef] [PubMed] [Google Scholar]
  13. Blasi J, Chapman ER, Yamasaki S, et al. Botulinum neurotoxin C1 blocks neurotransmitter release by means of cleaving HPC-1/syntaxin. EMBO J 1993 ; 12 : 4821–4828. [PubMed] [Google Scholar]
  14. Galli T, Chilcote T, Mundigl O, et al. Tetanus toxin-mediated cleavage of cellubrevin impairs exocytosis of transferrin receptor-containing vesicles in CHO cells. J Cell Biol 1994 ; 125 : 1015–1024. [CrossRef] [PubMed] [Google Scholar]
  15. Ferro-Novick S, Jahn R.. Vesicle fusion from yeast to man. Nature 1994 ; 370 : 191–193. [CrossRef] [PubMed] [Google Scholar]
  16. Galli T, Martinez Arca S, Paumet F.. Mécanisme de la fusion membranaire. Med Sci (Paris) 2002 ; 18 : 1113–1119. [CrossRef] [EDP Sciences] [Google Scholar]
  17. Seagar M, Quetglas S, Iborra C, Leveque C.. Le complexe SNARE au cœur de la fusion membranaire. Med Sci (Paris) 2001 ; 17 : 669–674. [CrossRef] [Google Scholar]
  18. Weber T, Zemelman BV, McNew JA, et al. SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion. Cell 1998 ; 92 : 759–772. [CrossRef] [PubMed] [Google Scholar]
  19. Hu C, Ahmed M, Melia TJ, et al. Fusion of cells by flipped SNAREs. Science 2003 ; 300 : 1745–1749. [CrossRef] [PubMed] [Google Scholar]
  20. Sutton RB, Fasshauer D, Reinhard J, Brunger AT.. Crystal structure of a SNARE complex involved in synaptic exocytosis at 2.4 Å resolution. Nature 1998 ; 395 : 347–353. [CrossRef] [PubMed] [Google Scholar]
  21. Li F, Pincet F, Perez E, et al. Energetics and dynamics of SNAREpin folding across lipid bilayers. Nat Struct Mol Biol 2007 ; 14 : 890–896. [CrossRef] [PubMed] [Google Scholar]
  22. Tareste D.. Énergie libérée par la machinerie de fusion SNAREpin. Med Sci (Paris) 2008 ; 24 : 142–143. [CrossRef] [EDP Sciences] [PubMed] [Google Scholar]
  23. Nonet ML, Saifee O, Zhao HJ, et al. Synaptic transmission deficits in Caenorhabditis elegans synaptobrevin mutants. J Neurosci 1998 ; 18 : 70–80. [PubMed] [Google Scholar]
  24. Deitcher DL, Ueda A, Stewart BA, et al. Distinct requirements for evoked and spontaneous release of neurotransmitter are revealed by mutations in the Drosophila gene neuronal-synaptobrevin. J Neurosci 1998 ; 18 : 2028–2039. [PubMed] [Google Scholar]
  25. Schoch S, Deak F, Konigstorfer A, et al. SNARE function analyzed in synaptobrevin/VAMP knockout mice. Science 2001 ; 294 : 1117–1122. [CrossRef] [PubMed] [Google Scholar]
  26. Washbourne P, Thompson PM, Carta M, et al. Genetic ablation of the t-SNARE SNAP-25 distinguishes mechanisms of neuroexocytosis. Nat Neurosci 2002 ; 5 : 19–26. [PubMed] [Google Scholar]
  27. FernandezChacon R, Konigstorfer A, Gerber SH, et al. Synaptotagmin I functions as a calcium regulator of release probability. Nature 2001 ; 410 : 41–49. [CrossRef] [PubMed] [Google Scholar]
  28. McMahon HT, Missler M, Li C, Südhof TC.. Complexins: cytosolic proteins that regulate SNAP receptor function. Cell 1995 ; 83 : 111–119. [CrossRef] [PubMed] [Google Scholar]
  29. Tang J, Maximov A, Shin OH, et al. A complexin/synaptotagmin 1 switch controls fast synaptic vesicle exocytosis. Cell 2006 ; 126 : 1175–1187. [CrossRef] [PubMed] [Google Scholar]
  30. Giraudo CG, Eng WS, Melia TJ, Rothman JE.. A clamping mechanism involved in SNARE-dependent exocytosis. Science 2006 ; 313 : 676–680. [CrossRef] [PubMed] [Google Scholar]
  31. Verhage M, Maia AS, Plomp JJ, et al. Synaptic assembly of the brain in the absence of neurotransmitter secretion. Science 2000 ; 287 : 864–869. [CrossRef] [PubMed] [Google Scholar]
  32. Hata Y, Slaughter CA, Sudhof TC. Synaptic vesicle fusion complex contains unc-18 homologue bound to syntaxin. Nature 1993 ; 366 : 347–351. [CrossRef] [PubMed] [Google Scholar]
  33. Shen J, Tareste D, Paumet F, et al. Selective activation of cognate SNAREpins by Sec1/Munc18 proteins. Cell 2007 ; 128 : 183–195. [CrossRef] [PubMed] [Google Scholar]
  34. Sudhof TC, Rothman JE. Membrane fusion: grappling with SNARE and SM proteins. Science 2009 ; 323 : 474–477. [CrossRef] [PubMed] [Google Scholar]
  35. Nicol X, Voyatzis S, Muzerelle A, et al. cAMP oscillations and retinal activity are permissive for ephrin signaling during the establishment of the retinotopic map. Nat Neurosci 2007 ; 10 : 340–347. [CrossRef] [PubMed] [Google Scholar]
  36. Zylbersztejn K, Petkovic M, Burgo A, et al. The vesicular SNARE Synaptobrevin is required for Semaphorin 3A axonal repulsion. J Cell Biol 2012 ; 196 : 37–46. [CrossRef] [PubMed] [Google Scholar]
  37. Zylbersztejn K, Galli T.. Le trafic membranaire, un nouvel acteur du guidage axonal. Med Sci (Paris) 2012 ; 28 : 267–269. [CrossRef] [EDP Sciences] [PubMed] [Google Scholar]
  38. Danielian S, Basile N, Rocco C, et al. Novel syntaxin 11 gene (STX11) mutation in three Argentinean patients with hemophagocytic lymphohistiocytosis. J Clin Immunol 2010 ; 30 : 330–337. [CrossRef] [PubMed] [Google Scholar]
  39. Cote M, Menager MM, Burgess A, et al. Munc18–2 deficiency causes familial hemophagocytic lymphohistiocytosis type 5 and impairs cytotoxic granule exocytosis in patient NK cells. J Clin Invest 2009 ; 119 : 3765–3773. [CrossRef] [PubMed] [Google Scholar]
  40. Menager MM, Menasche G, Romao M, et al. Secretory cytotoxic granule maturation and exocytosis require the effector protein hMunc13–4. Nat Immunol 2007 ; 8 : 257–267. [CrossRef] [PubMed] [Google Scholar]
  41. Feldmann J, Callebaut I, Raposo G, et al. Munc13–4 is essential for cytolytic granules fusion and is mutated in a form of familial hemophagocytic lymphohistiocytosis (FHL3). Cell 2003 ; 115 : 461–473. [CrossRef] [PubMed] [Google Scholar]
  42. Larghi P, Williamson DJ, Carpier JM, et al. VAMP7 controls T cell activation by regulating the recruitment and phosphorylation of vesicular Lat at TCR-activation sites. Nat Immunol 2013 ; 14 : 723–731. [CrossRef] [PubMed] [Google Scholar]

Liste des figures

thumbnail Figure 1.

Les découvertes de J. Rothman, R. Schekman et T. Südhof ont permis d’élucider les mécanismes moléculaires qui orchestrent le trafic vésiculaire. Une vésicule de transport fusionne avec une membrane cible lorsque la protéine v-SNARE de la vésicule s’assemble avec sa partenaire t-SNARE de la membrane cible. Dans le cas des événements de fusion dépendants du calcium (par exemple la neurotransmission), la fusion est déclenchée lorsque la protéine Synaptotagmine lie le calcium entraînant une série d’interactions avec les SNAREs et les membranes, qui conduisent à la fusion.

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