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Numéro
Med Sci (Paris)
Volume 23, Mars 2007
Protéomique clinique en oncologie
Page(s) 5 - 8
Section M/S revues
DOI https://doi.org/10.1051/medsci/2007231s5
Publié en ligne 15 mars 2007

© 2007 médecine/sciences - Inserm / SRMS

L’identification de biomarqueurs protéiques dans un échantillon sérique ou plasmatique se heurte à un certain nombre d’obstacles. L’un d’entre eux est la très grande hétérogénéité de la composition protéique du sérum ou du plasma, l’ordre de grandeur entre les protéines les plus abondantes et les protéines les moins abondantes étant d’environ 10 log [1, 2]. Du fait de l’abondance des protéines et de cette hétérogénéité, il est essentiel de savoir quelle partie du protéome est analysée par une méthode donnée. La détection de marqueurs biologiques de maladie fait habituellement appel à la comparaison de profils d’expression entre un état pathologique et l’état sain. Ces profils sont établis par des méthodes d’analyse directe en spectrométrie de masse après sélection de classes de protéines sur des surfaces fonctionnalisées ou sur des billes magnétiques. Une alternative est la comparaison de profils protéiques qui est depuis longtemps accessible par des techniques classiques d’analyse protéomique faisant appel à l’électrophorèse 2D et à la spectrométrie de masse. Ces techniques sont cependant peu appropriées à la détection de biomarqueurs de maladie dans un échantillon de sérum ou de plasma brut car ces biomarqueurs sont souvent parmi les protéines de faible abondance [3]. En effet, on recherche dans le liquide biologique, généralement le plasma, la marque d’un processus cellulaire ou métabolique qui se produit dans une partie peu accessible du corps humain. Lorsque ce processus conduit à la modification d’une protéine abondante du plasma pour produire un produit spécifique, par exemple un fragment de clivage, l’identification de cette modification peut être relativement aisée. Si ce processus touche une protéine de moindre importance, sa détection devient difficile.

Pour contourner cette difficulté, il est possible de réduire la complexité des échantillons protéiques avant l’analyse, de réduire son hétérogénéité et de l’enrichir en un sous-groupe pré-défini de protéines. Cela peut être fait par différentes approches, la plupart permettant d’isoler des classes distinctes de sous-protéomes (phospho-protéomes, glyco-protéomes) à l’intérieur du protéome total.

Une stratégie d’enrichissement de l’échantillon en deux étapes

Différentes stratégies ont été imaginées pour enrichir un échantillon de liquide biologique. À titre d’exemple, nous décrirons l’un des schémas que l’on peut suivre pour sélectionner un sous groupe de glycoprotéines dans le sérum. Ce schéma simple combine deux étapes complémentaires : la première étape est une incubation de l’échantillon en présence de protéine G agarose. La seconde étape est une incubation du sérum en présence concanavaline A sépharose. Les protéines éluées sont ensuite étudiées par électrophorèse (Figure 1).

thumbnail Figure 1.

Schéma général de la méthodologie de déplétion et d’enrichissement des protéines

Les billes de protéine G agarose permettent d’éliminer les immunoglobulines tandis que la concanavaline A sépharose permet d’éliminer l’albumine et d’enrichir l’échantillon en glycoprotéines. Le résultat est la déplétion des deux composants les plus abondants du sérum, c’est-à-dire l’albumine et les immunoglobulines, et l’enrichissement de l’échantillon en protéines glycosylées contenant de l’α-mannose.

Comme il est observé dans la Figure 2, la fraction non liée est très similaire au sérum avant séparation parce que l’albumine, la plus abondante des protéines du sérum, n’est pas glycosylée. Il en résulte une réduction de plus de 50 % du contenu total en protéines, mesuré en poids. Cette réduction concerne au moins 75 % des protéines de grande abondance. La composition protéique de l’échantillon étant simplifiée après ces deux étapes de séparation, il est possible de charger 20 fois plus d’échantillon dans un gel d’électrophorèse.

thumbnail Figure 2.

Gel d’électrophorèse du sérum. Ligne 1 : poids moléculaire ; ligne 2 : sérum non traité ; ligne 3 : fractions non liées à la concanavaline A ; ligne 4 : fractions liées à la concanavaline A. La déplétion de l’albumine et des γ-globulines permet de charger 20 fois plus de sérum sur le gel.

thumbnail Figure 3.

Comparaison de douze échantillons (6 malades et 6 témoins) par électrophorèse en gel à 4-12 % utilisant la procédure en deux étapes. Les flèches rouges indiquent les bandes dont l’intensité varie entre les deux groupes d’échantillons.

thumbnail Figure 4.

Les différentes phases de l’identification d’un biomarqueur à son utilisation en clinique. Ce schéma illustre la possibilité d’identifier des protéines par électrophorèse.

Un groupe distinct de protéines est enrichi dans la fraction liée à la concanavaline A, ce qui montre que la procédure enrichit l ’échantillon en protéines spécifiques. L’enrichissement en glycoprotéines est évalué entre 15 et 20 fois par différentes approches. C’est ce qui a été égalementobtenu avec des procédures de séparation fondées sur l’affinité des glycoprotéines pour la lectine [4]. Cette approche s’applique aussi bien aux échantillons issus de sujets normaux que ceux issus de malades et dans de nombreuses conditions différentes.

Pour tester directement l’efficacité de notre procédure et son application à la découverte de biomarqueurs, nous avons testé douze échantillons de sujets malades (n = 6) et non malades (n = 6) et la population enrichie de protéines montre effectivement des différences entre ces deux groupes de sujets, ce qui suggère que la procédure peut être utilisée pour identifier des protéines différentiellement exprimées. Les différences observées concernent notamment des protéines autour de 17 et de 40 kDa. Il y a également une hétérogénéité au niveau des protéines de faible poids moléculaire inférieur à 20 kDa. La nature et la valeur prédictive des marqueurs identifiés sont en cours d’analyse.

L’utilisation clinique des biomarqueurs identifiés

Lorsque les analyses protéomiques cliniques auront permis d’identifier un biomarqueur protéique ou une combinaison de biomarqueurs d’intérêt diagnostique ou pronostique, il faudra mettre au point un test de mesure de ce biomarqueur applicable en médecine quoitidienne et gérable dans un laboratoire d’analyses médicales. Les approches technologiques couramment utilisées dans les laboratoires d’analyses médicales sont relativement peu nombreuses. Il s’agit de l’électrophorèse des protéines, des études enzymatiques et spectrophotométriques, des tests immunologiques et des méthodes fondées sur la néphélométrie/turbidimétrie.

L’électrophorèse peut être appliquée à l’étude de n’importe quel liquide biologique. L’électrophorèse des protéines sériques distingue l’albumine des globulines réparties en quatre fractions, α1-, α2-, β- et γ -globulines. Dans ce système, les caractéristiques de migration des 22 protéines les plus abondantes du sérum, qui représentent plus de 99 % des protéines totales en poids, sont bien connues. L’électrophorèse des protéines sériques ou urinaires peut être complétée par une immunofixation détectant des protéines spécifiques à l’aide d’anticorps. L’avantage de l’approche électrophorètique pour rechercher une protéine est qu’elle permet de séparer et d’identifier les différentes isoformes de cette protéine. En outre, comme toute autre méthode immunologique, l’immunofixation a le mérite de la spécificité.

Les méthodes enzymatiques et spectrophotométriques sont les plus couramment utilisées dans les laboratoires d’analyses médicales. Ils permettent les analyses chimiques les plus courantes en mesurant le plus souvent les changements d’absorbance qui accompagnent la génération ou la déplétion de molécules comme le NAD ou le NADP au cours d’une réaction enzymatique. L’absorbance est corrélée, directement ou inversement, au niveau d’expression de la molécule d’intérêt. Cette approche a l’inconvénient de ne pas séparer les isoformes d’une même protéine.

Les méthodes immunologiques qui permettent de détecter et de quantifier un biomarqueur sont de nature variée. Les méthodes dites compétitives permettent de détecter des protéines de petite taille mais nécessitent de disposer d’une version purifiée ou recombinante de la molécule d’intérêt et la relation entre l’intensité du signal et la concentration de la molécule analysée est inverse. Les méthodes dites non compétitives peuvent détecter de plus grandes molécules mais nécessitent que la molécule ciblée contienne deux épitopes non chevauchant bien distincts et que des anticorps contre chaque épitope soient disponibles. La relation entre l’intensité du signal et la concentration de la molécule analysée est directe. Enfin, s’il s’agit de la recherche d’un auto-anticorps, des immuno-assays peuvent être utilisés qui nécessite une version purifiée ou recombinante de la protéine cible, généralement complexée avec une molécule génératrice d’un signal de fluorescence ou de chimioluminescence.

Enfin, la néphélométrie turbidimétrie est basée sur les changements des propriétés de réflexion de la lumière, laquelle est modifiée par la présence d’anticorps liés à leur antigène spécifique, ce qui permet d’établir des corrélations avec la quantité d’antigène.

Pour choisir le test approprié, on devra prendre en compte les caractéristiques de la cible d’intérêt, les avantages et les inconvénients des différentes méthodes, et la possibilité d’adapter les analyseurs à cette nouvelle mesure.

Conclusions

En conclusion, la déplétion des deux catégories de protéines les plus abondantes du sérum permet un enrichissement de l’échantillon analysé en glycoprotéines. C’est une procédure qui, comme toutes les autres procédures de séparation, permet d’analyser des sous classes du protéome humain plus facilement qu’en étudiant du sérum ou du plasma non déplété et facilite la découverte de nouveaux biomarqueurs. Lorsqu’un biomarqueur est identifié, son application au diagnostic et au suivi thérapeutique impose de choisir parmi les différentes méthodes utilisées couramment dans les laboratoires d’analyses médicales celle qui sera la plus appropriée à sa détection.

Remerciements

Je remercie M. German Echeverry pour sa remarquable assistance technique.

Références

  1. Anderson NL, Anderson NG. The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects. Mol Cell Proteomics 2002; 1 : 845–67. (Dans le texte)
  2. Omenn GS, States DJ, Adamski M, et al. Overview of the HUPO plasma proteome project: results from the pilot phase with 35 collaborating laboratories and multiple analytical groups, generating a core dataset of 3020 proteins and a publicly-available database. Proteomics 2005; 5 : 3226–45. (Dans le texte)
  3. Omenn GS. Advancement of biomarker discovery and validation through the HUPO plasma proteome project. Dis Markers 2004; 20 : 131–4. (Dans le texte)
  4. Qiu R, Regnier FE. Use of multidimensional lectin affinity chromatography in differential glycoproteomics. Anal Chem 2005; 77 : 2802–9. (Dans le texte)

Liste des figures

thumbnail Figure 1.

Schéma général de la méthodologie de déplétion et d’enrichissement des protéines

Dans le texte
thumbnail Figure 2.

Gel d’électrophorèse du sérum. Ligne 1 : poids moléculaire ; ligne 2 : sérum non traité ; ligne 3 : fractions non liées à la concanavaline A ; ligne 4 : fractions liées à la concanavaline A. La déplétion de l’albumine et des γ-globulines permet de charger 20 fois plus de sérum sur le gel.

Dans le texte
thumbnail Figure 3.

Comparaison de douze échantillons (6 malades et 6 témoins) par électrophorèse en gel à 4-12 % utilisant la procédure en deux étapes. Les flèches rouges indiquent les bandes dont l’intensité varie entre les deux groupes d’échantillons.

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Les différentes phases de l’identification d’un biomarqueur à son utilisation en clinique. Ce schéma illustre la possibilité d’identifier des protéines par électrophorèse.

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