Accès gratuit
Numéro
Med Sci (Paris)
Volume 20, Numéro 4, Avril 2004
Page(s) 465 - 473
Section Dossier technique
DOI https://doi.org/10.1051/medsci/2004204465
Publié en ligne 15 avril 2004

© 2004 médecine/sciences - Inserm / SRMS

Nous assistons, depuis l’avènement du marquage en bandes des chromosomes, à une véritable révolution technologique en cytogénétique humaine et animale. Après l’introduction en 1969 par M.L. Pardue et J.G. Gall [1] de l’hybridation in situ isotopique, il est devenu possible d’analyser des séquences d’ADN à l’intérieur des cellules sans altérer leur morphologie. En 1986, Pinkel et al. [2] puis Cremer et al. [3] ont introduit l’hybridation in situ fluorescente ou FISH (fluorescence in situ hybridization) avec des sondes non radioactives combinant les principes d’hybridation de l’ADN aux techniques d’immunofluorescence. En 1989, la technique de marquage non radioactif par synthèse in situ amorcée ou PRINS (primed in situ labelling) décrite par Koch et al. [4] va alors représenter un outil de recherche et de diagnostic en cytogénétique moléculaire (Figure 1). Comparée à la technique FISH, cette méthode offre de multiples avantages, notamment la simplicité de son protocole, la spécificité du marquage obtenu et son faible coût (Tableau I).

thumbnail Figure 1.

Schéma illustrant les deux étapes de la technique PRINS (marquage non isotopique par synthèse in situ amorcée) et ses principales applications. Un volume d’environ 45 μl d’un mélange réactionnel constitué entre autre d’une amorce (courte séquence oligonucléotidique de 18 à 35 nucléotides), de trois nucléotides non marqués et d’un nucléotide marqué (soit avec un haptène non fluorescent comme la biotine ou la digoxigénine, soit avec un fluorochrome) et de la Taq ADN polymérase est ajouté sur la lame. La première étape consiste en l’appariement des amorces non marquées à leur séquence d’ADN génomique complémentaire. La deuxième étape est une polymérisation à partir de l’extrémité 3’ du segment apparié par l’intermédiaire de la Taq ADN polymérase dont la fonction est de catalyser la réaction d’élongation. La présence du nucléotide marqué (dUTP sur la figure) permet la détection du fragment d’élongation nouvellement synthétisé. Dans le cas d’un couplage avec un haptène, la détection est faite à l’aide de différents systèmes de révélation (avidine-biotine, anticorps antidigoxigénine…). Dans le cas d’un marquage par un fluorochrome, la détection est directe. La durée de réalisation de la technique incluant la dénaturation des lames, la préparation des réactifs, les lavages et la révélation est d’environ 60 à 120 minutes. Les échantillons classiques d’exploitation du PRINS sont des préparations cytogénétiques, mais il est possible de réaliser ce type de réaction sur des coupes histologiques effectuées sous cryostat et sur des préparations de fibres d’ADN.

Tableau I.

Comparaison des techniques FISH et PRINS.

Le développement de cette méthode a permis de multiplier et de diversifier ses applications [5, 6]. Elle permet l’analyse des différentes familles de séquences d’ADN répétées telles que : (1) les séquences de type satellite α particulières aux centromères, les séquences satellites I, II, III et les séquences β-satellites spécifiques des régions péricentromériques et hétérochromatiques [7] ; (2) les séquences répétées Alu dispersées et préférentiellement localisées dans les bandes R (reverse) des chromosomes [8] ; (3) l’ADN minisatellite des séquences télomériques [9]. La spécificité chromosomique des séquences α-satellites qui ont été décrites pour tous les chromosomes humains a été mise à profit pour développer un marquage centromérique spécifique de la plupart des chromosomes [10]. Ces données ont été utilisées pour définir des amorces oligonucléotidiques spécifiques à chacun des chromosomes en les choisissant dans la région présentant le plus de polymorphisme nucléotidique. Ainsi, chaque amorce porte un nucléotide spécifique d’un chromosome à son extrémité 3’. Parallèlement, des améliorations techniques ont porté sur l’automatisation de la technique PRINS et le marquage simultané de plusieurs chromosomes [11]. Dans le domaine de la biologie humaine, elle a principalement servi au diagnostic cytopathologique [12] et cytogénétique [13]. De récents développements techniques ont permis la détection in situ de séquences uniques [1420], ouvrant ainsi de nouvelles perspectives pour cette technique.

Initialement, la technique PRINS était utilisée pour détecter un seul chromosome qui était révélé à l’aide d’un seul fluorochrome. Puis, divers protocoles PRINS polychromes (multicouleurs) ont été mis au point pour révéler simultanément plusieurs chromosomes. Le protocole le plus simple est réalisé en un seul cycle [20]. Il consiste à utiliser deux amorces oligonucléotidiques spécifiques de deux chromosomes donnés, dont l’une est marquée en 5’ avec un fluorochrome et l’autre non marquée. La couleur du fluorochrome utilisé pour l’élongation est différente de celle marquant l’amorce. La cible reconnue par cette amorce marquée aura une couleur composite provenant à la fois de l’hybridation de l’amorce et de l’élongation. Cette méthode permet ainsi de faire la discrimination entre les deux cibles. D’autres procédés permettent de détecter simultanément et spécifiquement plusieurs chromosomes avec des couleurs différentes sur la même cellule en interphase ou en division. Le marquage in situ de plusieurs chromosomes se fait de manière séquentielle, en utilisant plusieurs fluorochromes et en intercalant entre chaque réaction PRINS une phase de blocage au niveau de l’extrémité 3’ libre du fragment d’élongation synthétisé au cours de la réaction PRINS précédente. Une nouvelle approche plus simple et plus rapide a été récemment introduite par Yan et al. [21]. Ces auteurs ont démontré qu’à l’aide de trois amorces distinctes utilisées en trois réactions PRINS consécutives incorporant deux formes de dUTP (couplés à la biotine et à la digoxigénine) et de seulement deux fluorochromes (rhodamine et fluorescéine), il était possible de produire in situ trois marquages chromosomiques spécifiques révélés par trois couleurs différentes en omettant simplement l’étape de blocage en 3’ du segment d’élongation (Figure 2). L’obtention de trois couleurs distinctes (rouge, vert et jaune) est directement fonction de l’insertion des nucléotides marqués par un fluorochrome dans le fragment d’élongation produit au cours des trois réactions PRINS consécutives. Cette approche présente l’avantage d’éliminer l’étape de blocage qui rallonge la durée de la réaction globale. La succession de ces réactions peut être entièrement réalisée en l’espace de 90 minutes, diminuant le temps et le coût de la technique. En théorie, la combinaison Booléenne 2N- 1, où N représente le nombre de fluorochromes différents, peut être appliquée pour couvrir l’ensemble du génome humain. Cette nouvelle approche montre qu’il est possible de multiplier le nombre de couleurs et par conséquent le nombre de cibles autant de fois qu’on le souhaite.

thumbnail Figure 2.

Technique PRINS triple-couleurs. A. Schéma de la technique PRINS triple-couleurs développée par Yan et al. [21]. Après trois réactions PRINS consécutives, les cibles des chromosomes 7, 8 et 18 sont identifiées respectivement par les couleurs jaune, rouge et vert. Les flèches en pointillés situées sous l’ADN chromosomique indiquent les sites d’extension sur chaque brin du début à la fin de chaque réaction PRINS. La méthode illustrée ici correspond au marquage séquentiel (trois réactions successives) utilisant la biotine, la digoxigénine et la biotine. La détection est réalisée avec l’avidine-fluorescéine et l’anti-digoxigénine-rhodamine qui se lient respectivement à la biotine et à la digoxigénine. Les meilleurs résultats, pour la création de la couleur jaune, sont obtenus avec un rapport 2 : 1 de fluorescence verte par rapport à la fluorescence rouge. Cela est dû aux intensités d’excitation et d’émission supérieures du fluorochrome rouge par rapport à celles du fluorochrome vert. B. Détection simultanée de trois chromosomes par réaction PRINS triple-couleurs sur une métaphase et un noyau interphasique. Les deux signaux jaunes correspondent aux centromères des chromosomes 7 (première cible) et sont facilement reconnaissables. Les deux signaux rouges correspondent aux centromères des chromosomes 8 (deuxième cible) et les deux signaux purement verts représentent les centromères des chromosomes 18 (troisième cible).

La technique PRINS et les autres technologies

PRINS combinée à la technique FISH

On peut utiliser simultanément des marquages FISH et PRINS sur une même préparation cellulaire, ce qui rend possible la détection d’un nombre important de chromosomes [22] et l’identification du chromosome sur lequel est observé un signal FISH par un signal PRINS centromérique ou un marquage Alu [20]. Dans les cas d’hémopathies malignes à caryotype complexe, la combinaison des deux techniques a souvent été très utile pour détecter des anomalies de nombre et de structure présentes dans un même clone cellulaire. En effet, l’utilisation d’une amorce spécifique du centromère du chromosome 8 en technique PRINS jumelée à l’utilisation de sondes spécifiques des gènes Abl (Abelson) et Bcr (breakpoint cluster region) en technique FISH a permis de mettre en évidence des anomalies associées au sein d’une même cellule et issues d’un même clone cellulaire (Figure 3 A) [23].

thumbnail Figure 3.

Exemples d’application de la technique PRINS. A. La détection simultanée du chromosome philadelphie (les signaux jaunes caractérisés par un mélange de rouge et de vert sont indiqués par des flèches), du chromosome 9 (un des signaux verts sur chacun des noyaux) et du chromosome 22 (signal rouge sur chacun des noyaux) par technique FISH et la détection du chromosome 8 (tous les signaux verts sauf un) par la technique PRINS. Sur la photo figurent deux noyaux représentant deux clones différents. Le noyau de gauche contient un chromosome philadelphie (flèche) et une trisomie 8 alors que le noyau de droite montre deux chromosomes philadelphie (flèches) et une disomie 8. B. Métaphase partielle montrant la détection des télomères par PRINS sur des chromosomes de fibroblastes de souris. C. Détection d’une cellule fœtale mâle présente dans le sang périphérique maternel (X en rouge et Y en vert), entourée de cellules maternelles (deux chromosomes X en rouge).

Self-primed in situ labeling (SPRINS)

Le SPRINS est une technique hybride associant la technique PRINS à la translation de coupure (nick translation) in situ. Cette technique permet de déceler les cassures d’ADN produites par des enzymes de restriction ou induites par des agents clastogènes endommageant l’ADN, comme les rayons ultraviolets. Le principe en est simple : on utilise l’extrémité 3’ libre des cassures bicaténaires comme amorce de la réaction. Après traitement par les enzymes de restriction Hpall et Mspl, il est possible de détecter les îlots CpG et de faire l’étude de leur distribution et de leur méthylation sur les chromosomes humains. Les bandes chromosomiques G (Giemsa), riches en adénine et thymine, et R, riches en guanine et cytosine, possèdent des propriétés moléculaires et structurales différentes [24]. Les bandes R contiennent la plupart des gènes, notamment tous les gènes de ménage (housekeeping genes) et plusieurs gènes tissus spécifiques. On retrouve des ilôts CpG à l’extrémité 5’ des gènes de ménage et tissus spécifiques. Grâce à leur reconnaissance spécifique des séquences riches en GC, ces endonucléases combinées au SPRINS permettent un marquage chromosomique de type bandes R. Cette même technique a, par ailleurs, permis la détection du nombre de copies des chromosomes, l’analyse des différences de méthylation des chromosomes X et des chromosomes homologues acrocentriques [25].

PRINS et marquage en immunofluorescence

La capacité de marquer par fluorescence sur une même lame des cibles d’ADN et de protéines ouvre des possibilités d’investigation très intéressantes. La production simultanée de signaux par cytogénétique moléculaire et par immunologie ne semble pas aisée car, à notre connaissance, une seule publication fait état de résultats satisfaisants en utilisant la technique FISH [20]. Dans le but d’étudier la ségrégation des chromosomes durant le processus de polyploïdisation des mégacaryocytes destinés à fournir des plaquettes, nous avons, après quelques essais infructueux avec FISH, développé une méthode combinant la réaction PRINS et l’immunofluorescence. Après déshydratation, la réaction PRINS, qui permet le marquage du centromère d’un chromosome présélectionné, est immédiatement suivie par les réactions antigéniques permettant de révéler les fuseaux achromatiques via un anticorps antitubuline [26] (Figure 4). Une asymétrie dans la ségrégation des chromosomes a ainsi pu être mise en évidence [27]. Nous pensons que les avantages du PRINS tiennent, d’une part, à sa rapidité d’exécution, qui évite le contact prolongé des protéines avec la formamide contenue dans les solutions d’hybridation de la technique FISH et, d’autre part, à la masse stérique plus réduite de ses réactifs, qui assure une pénétration plus facile dans les échantillons.

thumbnail Figure 4.

Technique PRINS associée à l’immunofluorescence. Exemple d’une ségrégation asymétrique des chromosomes 1 au stade anaphase des endomitoses mégacaryocytaires (4n Æ 8n). A. Les signaux verts (FITC : fluorescéine isothiocyanate) correspondent aux centromères des chromosomes 1. B. Les microtubules du fuseau mitotique sont immunocolorés en rouge (TRITC : tétraméthyl rhodamine isothiocyanate). C. L’ADN des noyaux est contre-coloré en bleu (iodure de TOTO3). D. Superposition des trois marqueurs (photographie reproduite avec la permission de Blood [26]).

Principales applications de la technique PRINS

Applications fondamentales de la technique PRINS

Analyse de la structure chromosomique

L’utilisation de la méthode PRINS avec des amorces spécifiques des centromères humains et des séquences Alu a permis la caractérisation d’hybrides somatiques et de lignées cellulaires tumorales. Les séquences Alu sont particulièrement concentrées au niveau des bandes R. Cette spécificité a été mise à profit pour effectuer la détection simple et rapide du matériel chromosomique humain présent dans des hybrides somatiques interespèces [8].

La technique PRINS a aussi été très largement utilisée pour localiser les séquences télomériques (TTAGGG)n sur des préparations chromosomiques d’origines diverses. Chez l’homme, cette approche a permis d’étudier les variations de la taille des séquences télomériques [28]. Un travail similaire a été réalisé dans nos laboratoires sur des fibroblastes d’embryons de souris [29] (Figure 3B) et diverses espèces d’oiseaux [20]. Chez les primates prosimiens (lémuriens), l’étude des régions télomériques a contribué à l’identification des remaniements chromosomiques à l’origine de la formation des chromosomes métacentriques et submétacentriques [30].

La colocalisation par PRINS des séquences télomériques et centromériques sur des cellules soumises à des agents bloquant la cytokinèse a aidé à comprendre les mécanismes à l’origine des micronoyaux spontanés et induits [31]. On admet que les micronoyaux peuvent résulter soit d’une malségrégation des chromosomes avec centromères et télomères présents, soit de cassures chromosomiques avec perte de centromères. L’étude de la mécanique chromosomique montre que l’accident le plus fréquent qui conduit à la formation d’un micronoyau est représenté par une non-disjonction suivie d’une perte de chromosomes. Russo et al. [32] ont décrit un protocole PRINS démontrant une double détection des séquences d’ADN satellite centromérique et péricentromérique. Cette approche a permis d’évaluer les séquences préférentiellement impliquées dans la formation des dommages chromosomiques à l’origine des micronoyaux.

Une autre application intéressante de la technique PRINS est son utilisation sur des fibres de chromatine. Le traitement des cellules avec une forte concentration de sel ou avec des détergents hyperalcalins permet de libérer la chromatine des noyaux. La chromatine décondensée (0,34 μm/kb) apparaît sous forme de fibres ou de halos d’ADN. Après révélation, les signaux fluorescents s’alignent sur la fibre à la manière d’un « collier de perles ». Cette méthode permet une mesure relativement précise de la distance physique (1 à 5 kb) entre deux séquences d’ADN connues [33].

Détection des séquences uniques d’ADN

En 1993, une étude rapportait la localisation du gène codant pour le facteur IX antihémophilique sur le chromosome X humain [34] et, en 1994, une autre étude rapportait celle de microsatellites porcins [35] par une méthode connue sous l’appellation de DISC-PCR (direct in situ single copy-PCR). Toutefois, les protocoles utilisés n’ont jamais permis de reproduire les résultats publiés. Ces échecs semblent essentiellement dus à la faible extension de l’élongation, qui ne dépasse pas une centaine de paires de bases [36].

Une étape importante a été franchie avec la publication de l’identification in situ des gènes SRY et SOX3 [14, 15]. Les protocoles développés par Kadandale et al. [15, 16] renouent avec la simplicité initiale de la technique PRINS où chaque étape a été optimisée pour amplifier fortement le signal sans produire de bruit de fond. Ces protocoles permettent une localisation efficace et reproductible de séquences uniques, sans alourdissements ou modifications considérables de la méthode de base. Outre l’utilisation de plusieurs amorces en une seule étape d’appariement et d’extension, un anticorps inactivant la Taq ADN polymérase (principe de la technique hotstart) est aussi utilisé pour augmenter la sensibilité lors de la réaction d’élongation. Cependant, l’élément novateur est un système d’amplification du signal fondé sur la technique CARD (catalyzed reporter deposition) qui utilise un composé phénolique, la tyramine biotinylée (tyramide). Cette dernière réagit rapidement avec des espèces réactives de l’oxygène au niveau du site de liaison de l’anticorps antihaptène conjugué à la peroxydase et du nucléotide marqué. La réaction, en présence d’espèces réactives de l’oxygène dérivées du peroxyde d’hydrogène (H2O2) et de tyramines couplées à un haptène non fluorescent ou à un fluorochrome, réalise le dépôt in situ de la tyramine activée. La détection du signal ainsi amplifié (jusqu’à 100 fois) se fait par méthode immunohistochimique.

Détection des séquences uniques d’ARN

Il est aussi possible de détecter les acides ribonucléiques (ARN) in situ grâce à une modification de la technique PRINS. La transcriptase inverse est utilisée pour catalyser la réaction de polymérisation de l’ADN complémentaire à l’aide de désoxyribonucléotides [37]. Cette réaction PRINS-ARN permet la détection des ARN dans les cellules hématopoïétiques en suspension, avec quantification en cytométrie de flux [38].

Applications médicales de la technique PRINS

Diagnostic prénatal invasif et non invasif

Plusieurs équipes ont rapporté l’identification d’aneuploïdies sur des prélèvements de liquide amniotique et de villosités choriales à l’aide d’amorces centromériques spécifiques, notamment celles des chromosomes 13, 16, 18, 21, X et Y [13]. Dans tous les cas étudiés, les résultats obtenus concordaient avec ceux du caryotype. La rapidité d’exécution du PRINS trouve tout son intérêt dans ce type d’application. De nouvelles approches non invasives de détection des cellules fœtales présentes dans le sang maternel ont bénéficié de la technique PRINS. L’étude réalisée par Orsetti et al. [39] a permis d’identifier des cellules fœtales en utilisant un protocole d’isolement par centrifugation sur double gradient d’Histopaque combiné au PRINS. Notre récente étude [40] a confirmé l’efficacité de la technique PRINS comme alternative à la technique FISH pour la quantification du nombre total de cellules fœtales nucléées circulantes dans le sang maternel pendant le second trimestre de la grossesse. Un nombre total de deux à six cellules fœtales par millilitre de sang a pu ainsi être déterminé (Figure 3C). Un travail similaire réalisé sur des femmes enceintes de fœtus aneuploïdes est actuellement en cours. Les résultats préliminaires observés chez 10 de ces femmes montrent que le nombre de cellules fœtales est en moyenne 5 fois plus élevé que dans les grossesses normales (K. Krabchi et al., données non publiées).

Études gamétiques et diagnostic préimplantatoire

Des études sur gamètes permettant l’estimation directe des taux d’aneuploïdie et de diploïdie dans les spermatozoïdes humains de sujets normaux ou porteurs de remaniements chromosomiques ont été rapportées [41]. Compte tenu de l’extrême compactage du noyau spermatique, la petite taille des amorces confère un réel avantage à la technique PRINS. L’analyse par PRINS polychrome a permis l’étude de la ségrégation méiotique de translocations réciproques sur spermatozoïdes. Le nombre important de spermatozoïdes pouvant être analysés à partir d’un seul éjaculat permet de définir avec précision l’incidence des différentes formes de déséquilibres chromosomiques présentes dans le sperme de chaque porteur de translocation [42]. L’information fournie peut s’avérer capitale lors du conseil génétique en vue d’une procréation médicalement assistée.

Une application diagnostique directe du PRINS a été testée avec succès sur des cellules blastomériques humaines [43]. Dans le cadre d’un diagnostic chromosomique préimplantatoire, la rapidité et la spécificité de la réaction PRINS constituent des paramètres importants au regard de la fenêtre d’intervention très étroite imposée par les protocoles de fécondation in vitro humaine. Enfin, l’utilisation du PRINS a récemment été étendue à l’étude chromosomique du premier globule polaire à la suite d’échecs de fécondation in vitro humaine [44].

Études oncohématologiques

La technique PRINS n’a été appliquée que récemment dans le diagnostic oncologique. Elle permet l’estimation précise du pourcentage de cellules aneuploïdes en évaluant non seulement les cellules en division, mais aussi les cellules en interphase. Dans certaines situations, la culture cellulaire ne serait donc plus obligatoire. On élimine ainsi la possibilité d’une évaluation cytogénétique erronée par l’avantage prolifératif d’un clone cellulaire génétiquement anormal. Dans cette optique, un travail réalisé dans notre laboratoire a permis d’analyser l’implication des anomalies cytogénétiques de nombre des chromosomes 7 et 8 chez 54 individus souffrant de désordres hématologiques [45]. Cette étude a clairement démontré que la trisomie 8 conférait un avantage prolifératif. Une autre étude comparative entre les techniques FISH, PRINS et cytogénétiques conventionnelles a été réalisée par G.V. Velagaleti et al. sur des cultures de moelle osseuse [46]. Par ailleurs, F. Pellestor et al. ont étudié l’hétérogénéité et l’instabilité chromosomique de plusieurs lignées tumorales coliques [47]. Enfin, B. Marie et al. ont rapporté la détection des chromosomes X et Y sur des préparations de leucocytes sanguins et médullaires et ont démontré l’intérêt de la technique PRINS dans le suivi des patients ayant fait l’objet d’une allogreffe de moelle osseuse avec un donneur de sexe opposé [48].

Détection du génome viral

Cette application très récente découle de l’adaptation de la technique PRINS aux échantillons de coupes histologiques [12, 20, 49]. Les techniques FISH et PRINS ont été utilisées avec succès pour détecter le génome viral du virus HPV (human papillomavirus) [50]. Cette étude rapporte une plus grande proportion de cellules positives par PRINS que par FISH. La meilleure sensibilité du PRINS est probablement due à la plus grande pénétrabilité de l’amorce. D’autre part, la réaction PRINS a permis la quantification des virus recombinants en déterminant le titre rétroviral et l’efficacité de la transduction virale. Cette évaluation représente une étape cruciale dans le cadre de la thérapie génique avec vecteurs viraux [51].

Détection des séquences uniques

Dans un numéro de l’ American Journal of Medical Genetics a été publiée une série d’articles concernant l’utilisation de la technique PRINS dans la détection de séquences uniques impliquées dans des syndromes avec microdélétion à l’échelle d’un gène. [1619] (Tableau II).

Tableau II.

Exemples d’applications de la technique PRINS dans la détection des séquences uniques d’ADN. Concordance totale entre les résultats obtenus par PRINS et par FISH (les deux techniques ont été utilisées sur 20 métaphases et 80 noyaux interphasiques).

Il est intéressant d’évoquer certaines perspectives envisageables dans le futur, en particulier l’application de la technique PRINS dans la détection des gènes de fusion résultant d’une translocation réciproque : gène de fusion bcr/abl de la leucémie myéloïde chronique en rapport avec une translocation t(9 ; 22)(q34.1 ; q11.2) ; gène de fusion PML/RARA des leucémies aiguës myéloblastiques dû à la translocation t(15 ; 17)(q22 ; q21) ; gène de fusion EWS/FLI-1, observé dans 85 % des sarcomes d’Ewing, en rapport avec une translocation t(11 ; 22)(q24 ; q12).

Conclusions

Actuellement, la réaction PRINS peut être très avantageusement combinée à la technique FISH dans les cas où un gène de fusion et une aneuploïdie doivent être recherchés dans une même cellule. La technique PRINS devrait remplacer la technique FISH dans toutes les situations de détermination du sexe chromosomique, de recherche d’aneuploïdie et de diagnostic d’un syndrome microdélétionnel.

Par les nombreux avantages qu’elle offre, la technique PRINS constitue un outil puissant, simple et universel adapté à la cytogénétique moléculaire. Elle représente une excellente alternative à la technique FISH tant sur le plan de la recherche scientifique que de l’investigation génétique clinique en pratique médicale. Son développement et sa diffusion dans les laboratoires de cytogénétique témoignent de son efficacité. Les progrès techniques qui en découlent renforcent les espérances fondées sur cette technique. La détection in situ de séquences uniques apporte une contribution significative à l’avancement des connaissances en biologie appliquée particulièrement dans la compréhension de certaines entités nosologiques. Cet apport constitue une réelle consécration de la technique PRINS et contribue largement à en faire une technique de choix de cytogénétique moléculaire.

Remerciements

Les travaux présentés dans cet article ont été financés par le Réseau Canadien des Maladies Génétiques (CGDN) et le Réseau de Médecine Génétique Appliquée (RMGA) du Québec. Les travaux de P. Coullin ont bénéficié de fonds provenant de l’Inserm et du CNRS. La Figure 4 a été réalisée au cours de travaux faits en collaboration avec Lydia Roy (Inserm U.362, Villejuif). Les travaux de F. Pellestor sur le PRINS sont financés par une subvention de l’Association Française contre les Myopathies (AFM) et un contrat européen COPERNICUS-2 (ICA2-CT2000-10012). R. Drouin détient une bourse de chercheur-boursier (niveau senior) du Fonds de la Recherche en Santé du Québec (FRSQ).

Références

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Liste des tableaux

Tableau I.

Comparaison des techniques FISH et PRINS.

Tableau II.

Exemples d’applications de la technique PRINS dans la détection des séquences uniques d’ADN. Concordance totale entre les résultats obtenus par PRINS et par FISH (les deux techniques ont été utilisées sur 20 métaphases et 80 noyaux interphasiques).

Liste des figures

thumbnail Figure 1.

Schéma illustrant les deux étapes de la technique PRINS (marquage non isotopique par synthèse in situ amorcée) et ses principales applications. Un volume d’environ 45 μl d’un mélange réactionnel constitué entre autre d’une amorce (courte séquence oligonucléotidique de 18 à 35 nucléotides), de trois nucléotides non marqués et d’un nucléotide marqué (soit avec un haptène non fluorescent comme la biotine ou la digoxigénine, soit avec un fluorochrome) et de la Taq ADN polymérase est ajouté sur la lame. La première étape consiste en l’appariement des amorces non marquées à leur séquence d’ADN génomique complémentaire. La deuxième étape est une polymérisation à partir de l’extrémité 3’ du segment apparié par l’intermédiaire de la Taq ADN polymérase dont la fonction est de catalyser la réaction d’élongation. La présence du nucléotide marqué (dUTP sur la figure) permet la détection du fragment d’élongation nouvellement synthétisé. Dans le cas d’un couplage avec un haptène, la détection est faite à l’aide de différents systèmes de révélation (avidine-biotine, anticorps antidigoxigénine…). Dans le cas d’un marquage par un fluorochrome, la détection est directe. La durée de réalisation de la technique incluant la dénaturation des lames, la préparation des réactifs, les lavages et la révélation est d’environ 60 à 120 minutes. Les échantillons classiques d’exploitation du PRINS sont des préparations cytogénétiques, mais il est possible de réaliser ce type de réaction sur des coupes histologiques effectuées sous cryostat et sur des préparations de fibres d’ADN.

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thumbnail Figure 2.

Technique PRINS triple-couleurs. A. Schéma de la technique PRINS triple-couleurs développée par Yan et al. [21]. Après trois réactions PRINS consécutives, les cibles des chromosomes 7, 8 et 18 sont identifiées respectivement par les couleurs jaune, rouge et vert. Les flèches en pointillés situées sous l’ADN chromosomique indiquent les sites d’extension sur chaque brin du début à la fin de chaque réaction PRINS. La méthode illustrée ici correspond au marquage séquentiel (trois réactions successives) utilisant la biotine, la digoxigénine et la biotine. La détection est réalisée avec l’avidine-fluorescéine et l’anti-digoxigénine-rhodamine qui se lient respectivement à la biotine et à la digoxigénine. Les meilleurs résultats, pour la création de la couleur jaune, sont obtenus avec un rapport 2 : 1 de fluorescence verte par rapport à la fluorescence rouge. Cela est dû aux intensités d’excitation et d’émission supérieures du fluorochrome rouge par rapport à celles du fluorochrome vert. B. Détection simultanée de trois chromosomes par réaction PRINS triple-couleurs sur une métaphase et un noyau interphasique. Les deux signaux jaunes correspondent aux centromères des chromosomes 7 (première cible) et sont facilement reconnaissables. Les deux signaux rouges correspondent aux centromères des chromosomes 8 (deuxième cible) et les deux signaux purement verts représentent les centromères des chromosomes 18 (troisième cible).

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thumbnail Figure 3.

Exemples d’application de la technique PRINS. A. La détection simultanée du chromosome philadelphie (les signaux jaunes caractérisés par un mélange de rouge et de vert sont indiqués par des flèches), du chromosome 9 (un des signaux verts sur chacun des noyaux) et du chromosome 22 (signal rouge sur chacun des noyaux) par technique FISH et la détection du chromosome 8 (tous les signaux verts sauf un) par la technique PRINS. Sur la photo figurent deux noyaux représentant deux clones différents. Le noyau de gauche contient un chromosome philadelphie (flèche) et une trisomie 8 alors que le noyau de droite montre deux chromosomes philadelphie (flèches) et une disomie 8. B. Métaphase partielle montrant la détection des télomères par PRINS sur des chromosomes de fibroblastes de souris. C. Détection d’une cellule fœtale mâle présente dans le sang périphérique maternel (X en rouge et Y en vert), entourée de cellules maternelles (deux chromosomes X en rouge).

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thumbnail Figure 4.

Technique PRINS associée à l’immunofluorescence. Exemple d’une ségrégation asymétrique des chromosomes 1 au stade anaphase des endomitoses mégacaryocytaires (4n Æ 8n). A. Les signaux verts (FITC : fluorescéine isothiocyanate) correspondent aux centromères des chromosomes 1. B. Les microtubules du fuseau mitotique sont immunocolorés en rouge (TRITC : tétraméthyl rhodamine isothiocyanate). C. L’ADN des noyaux est contre-coloré en bleu (iodure de TOTO3). D. Superposition des trois marqueurs (photographie reproduite avec la permission de Blood [26]).

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