Analyse du rôle de miR-9 dans la régulation de la MHB. A. Expression de miR-9 chez un embryon de Danio zébré au stade 35 hpf (heures post-fécondation) révélée par hybridation in situ (marquage bleu). miR-9 est exprimé dans le mésencéphale et le rhombencéphale mais est absent de la MHB (flèche bleue). B. Sensor assays. Un ARNm rapporteur comprenant la séquence codante de la GFP suivie de la région 3’UTR de la cible présumée (her5 ou fgfr1 dans ce cas) est injecté dans un embryon au stade une cellule, en combinaison avec le microARN miR-9 sous forme de duplex, ou d’un microARN contrôle (CTR). L’effet de miR-9 sur la traduction de la protéine indicatrice GFP est analysé par Western blot avec un anticorps spécifique de la GFP. Un anticorps anti-tubuline est également utilisé pour contrôler la charge du gel d’électrophorèse. Le Western blot révèle une quantité de GFP réduite par rapport au contrôle lorsque les embryons sont injectés avec miR-9. Cette expérience démontre que miR-9 est capable d’interagir avec les régions 3’UTR des gènes her5 et fgfr1. C. Effet de la surexpression de miR-9. (en haut) Au stade 24 hpf, la MHB est visible morphologiquement chez les embryons injectés avec un microARN contrôle (flèche bleue) et non chez les embryons injectés avec un duplex miR-9 (astérisque rouge). (2^e et 3^e lignes) L’hybridation in situ avec des sondes spécifiques des gènes wnt1 et dusp6 montre que l’expression de ces gènes au niveau de la MHB au stade 12 somites (flèche bleue chez les embryons contrôles) est réduite chez les embryons injectés avec miR-9 (astérisque rouge). (4^e ligne) Chez les embryons contrôles, le gène neurogenin1 (neurog1) est exprimé spécifiquement par les précurseurs neuronaux du mésencéphale (vcc : ventro-caudal cluster) et du rhombencéphale (r2MN : précurseurs de motoneurones du rhombomère 2). Il est absent de la MHB (crochet). Chez les embryons injectés avec miR-9, une expression ectopique de neurog1 est détectée au niveau de la MHB (astérisque rouge). D. Expérience de protection de cible. Les embryons au stade une cellule sont injectés avec miR-9 et un morpholino protecteur de cible qui empêche la liaison de miR-9 sur la région 3’UTR des gènes fgfr1 ou her5. Alors que les embryons injectés avec miR-9 présentent une absence d’expression de wnt1 au niveau de la MHB au stade 20 somites (astérisque rouge), les embryons co-injectés avec le protecteur de fgfr1 ou her5 montrent une expression restaurée de ce gène au niveau de la MHB (flèche bleue). E. Effet de l’inhibition de miR-9 par injection de morpholino (MO). (en haut) Coupes sagittales d’embryons injectés avec un MO contrôle (gauche) ou dirigé contre miR-9 (droite), hybridés avec une sonde spécifique du gène dusp6. L’injection du morpholino miR-9 conduit à un élargissement du domaine d’expression de dusp6 en comparaison avec les embryons contrôles. (en bas) Immunohistochimie sur coupes transversales du tube neural avec des anticorps dirigés contre la phosphohistone H3 (pH3, rouge) qui marque les cellules en prolifération, et contre la protéine HuC, qui marque les neurones en différenciation (cyan). Chez les embryons injectés avec le MO miR-9 (au milieu) la surface du tube neural marquée par l’anticorps anti-HuC est réduite par rapport aux embryons contrôles (à gauche). La co-injection d’un MO dirigé contre her9 restaure une situation comparable aux embryons contrôles (à droite). F. Modèle d’action de miR-9. miR-9 (vert) est exprimé dans le tube neural à l’exception de la MHB, permettant de restreindre l’activité des gènes her et de la voie FGF à cette région.