Figure 1. Principe de la microscopie à super-résolution STED. A. Diagramme de Jablonski expliquant le phénomène de fluorescence. La protéine GFP, (green fluorescent protein) illuminée par un laser de couleur bleue (lumière d’excitation, 485 nm), absorbe l’énergie des photons de cette lumière et atteint un état dit « excité ». Son excitation est transitoire et le retour à l’état fondamental s’accompagne d’une émission de fluorescence de couleur verte (510 nm). La protéine GFP peut également retrouver son état fondamental sans émettre de fluorescence verte. Ce phénomène, appelé émission stimulée, permet d’« éteindre » la fluorescence émise dans le vert en illuminant la protéine GFP excitée par un laser de déplétion (laser de couleur orange, 595 nm). B. Le principe de la microscopie STED est d’illuminer l’échantillon simultanément avec un laser d’excitation et un laser de déplétion. Le laser de déplétion est en forme d’anneau. Ainsi à son centre, les fluorophores présents sont illuminés uniquement par le laser d’excitation et donc émettent de la fluorescence. En revanche, ceux présents en périphérie sont « éteints » par émission stimulée. Cette technique permet d’atteindre une résolution d’environ 50 nm. L’augmentation de l’intensité du laser de déplétion permet de réduire la taille de la zone de fluorescence effective et ainsi, d’améliorer la résolution. C. Image de dendrites de neurones obtenue par microscopie confocale et STED. D. Photographie des composants optiques du microscope à super-résolution STED construit dans notre laboratoire.