Étude globale de la traduction cellulaire par profilage ribosomique. A. Les cellules ou tissus d’intérêt sont traités avec des inhibiteurs de la traduction comme le cycloheximide dans le but de figer les ribosomes sur les ARNm qu’ils traduisent. Les cellules ou tissus d’intérêt sont ensuite lysés et la fraction cytoplasmique récupérée (compartiment où a lieu la traduction des ARNm). Les lysats obtenus sont ensuite séparés en deux fractions. La première est utilisée pour extraire les ARNm et mesurer leur niveau d’expression par séquençage massif parallèle (RNA-sequencing, RNA-Seq). La deuxième fraction est incubée avec des ribonucléases (généralement avec la RNase I qui clive l’ARN simple brin quelle que soit la séquence nucléotidique) qui vont dégrader toutes les régions d’ARN accessibles à l’exception de celles qui sont associées aux protéines liant l’ARN et celles associées aux ribosomes 80S. Les ribosomes étant plus denses et volumineux que les protéines libres et autres complexes ribonucléoprotéiques, ils peuvent être purifiés sur un gradient de sucrose, sur coussin de sucrose ou par chromatographie d’exclusion. Une fois les ribosomes 80S isolés, les fragments d’ARNm protégés sont récupérés puis utilisés pour préparer des banques d’ADN complémentaire (ADNc) qui seront finalement séquencées. Une fois les résultats du séquençage obtenus, les séquences protégées par le ribosome ainsi que les séquences correspondant au RNA-Seq (ARNm en entier) sont alignées contre le génome de référence correspondant à l’espèce du matériel de départ. Une fois les alignements obtenus, l’expérimentateur peut mesurer la densité de ribosomes par molécule d’ARNm en calculant le ratio entre le nombre de séquences protégées par les ribosomes pour un ARNm donné et le nombre de séquences obtenues pour le même ARNm à partir du RNA-Seq. B.  Les fragments protégés font généralement entre 26 et 31 nt (nucléotides) de long (la majorité des fragments font 28 nt de long). En conséquence, il est possible de retrouver la phase de lecture en prenant comme information la position du premier nucléotide de chaque séquence. C.  Exemple de résultat obtenu par profilage ribosomique et RNA-Seq sur le gène humain codant la glycéraldéhyde-3-phosphate déhydrogénase (GAPDH). Sur le panel du haut (ribosome profiling), le nombre de fragments protégés par le ribosome est présenté en ordonnée par rapport à chaque position du transcrit codant la GAPDH présentée en abscisse. Sur le panel du bas (RNA-Seq), est présenté le nombre de fragments d’ARNm séquencés pour chaque position du transcrit codant la GAPDH. On peut observer que le signal correspondant au profilage ribosomique est limité à la région codante du transcrit alors que le signal correspondant au RNA-Seq s’étend sur les régions 5’ et 3’ non traduites. OFR : open reading frame.