Avantages et limites de la M2P pour la résolution spatiale. A. Images 2D du profil d’intensité lumineuse de points focaux (1P ; dans le plan xz ou yz à 450 et 800 nm, respectivement) et intensité au carré à 800 nm (2P) obtenus par simulation. L’ouverture numérique de l’objectif est de 0,5 et le coefficient d’absorption est nul. La perte de résolution en utilisant une longueur d’onde plus grande (la résolution est proportionnelle à la largeur à mi-hauteur des points focaux) se trouve compensée par le fait que l’absorption de 2P est proportionnelle à l’intensité au carré. Le résultat net est que la résolution radiale avec une excitation à 2P à 800 nm est comparable à celle obtenue avec 1P à 450 nm. B. Coefficient d’absorption des principaux absorbeurs dans les tissus en fonction de la longueur d’onde. Notez l’absorption 10 à 100 fois plus faible à 800 nm qu’à 450 nm (flèches) due à la présence d’éléments absorbant dans le tissu (mélamine, hémoglobine…). C. Profil de l’intensité lumineuse à 1P (gauche) et profil de l’intensité au carré à 2P (droite) obtenus par simulation en tenant compte, cette fois-ci, du coefficient d’absorption. La valeur du coefficient d’absorption est de 85 cm^-1 dans le cas à 1P et de 8,5 cm^-1 dans le cas à 2P (ouverture numérique = 0,16). D. Image d’un neurone pyramidal du néocortex exprimant la green fluorescent protein (GFP) à faible grossissement à gauche et avec un grossissement croissant vers la droite pour illustrer le détail des prolongements du neurone : le panneau du milieu met en évidence une dendrite ; le panneau de droite les détails d’épines dendritiques. Comme les épines ont une taille de l’ordre du micromètre, la résolution optique standard ne permet pas de distinguer leur structure fine. E. Exemple de technique utilisée pour augmenter la résolution en deçà des limites de diffraction de la lumière : la STED (stimulated emission depletion). On excite l’échantillon avec une impulsion laser de la même façon qu’on le fait en M2P. Par la suite, avant que les fluorophores réémettent la fluorescence, on désexcite les molécules autour du point focal par émission stimulée avec une impulsion en forme de beigne. Le volume d’excitation correspond alors à une soustraction entre le volume d’excitation et le volume de désexcitation autour du point focal. Les molécules encore excitées sont alors dans un volume beaucoup plus petit que le point d’excitation engendré par l’excitation, ce qui améliore la résolution radiale. (E1) présente le profil d’intensité de l’impulsion laser d’excitation, (E2) le profil d’intensité du faisceau en beigne qui suit l’impulsion d’excitation. (E3) montre le profil d’excitation résultant après le passage des deux premières impulsions, (E4) le profil inverse du beigne.