Comment améliorer la résolution optique ? A. L’émission de fluorescence peut être déplétée selon le principe du STED (stimulated emission depletion). La zone d’excitation est restreinte optiquement par un deuxième laser en forme d’anneau, placé autour du faisceau d’excitation et bloquant la fluorescence. Ceci permet de générer une région d’excitation de taille réduite, quasi nanométrique [27]. B. La stimulation et l’extinction successive de quelques fluorochromes permettent de localiser les molécules marquées avec une précision proche du nanomètre. Après chaque stimulation, suffisamment brève, seules quelques molécules sont activées et analysées individuellement. Citons les techniques du PALM (photo-activated localization microscopy) [28], qui exploite un variant photoactivable de la GFP, et celle du STORM (stochastic optical reconstruction microscopy) [29], qui utilise les propriétés de clignotement aléatoire des fluorochromes. C. La réflexion totale interne (TIRF, total internal reflexion fluorescence) utilise une configuration optique très particulière : le laser d’excitation n’arrive pas directement, mais avec un angle d’inclinaison très important (via l’objectif ou un prisme). Le laser ne pénètre pas dans l’échantillon, mais génère une onde dite évanescente, confinée à ≈ 100 nm de l’interface avec la lamelle [30]. La résolution axiale est affinée, mais l’observation est intrinsèquement limitée à cette interface qui correspond, pour une cellule adhérente, à la membrane basale et à son environnement immédiat.