Mobilité des molécules et méthodes d’analyse. A. La mobilité des molécules relève schématiquement de trois processus élémentaires : (1) mobilité entretenue par la diffusion, conséquence inévitable de l’agitation thermique en solution, caractérisée par un coefficient de diffusion ; (2) mouvement directionnel, produit soit par un écoulement, soit par les moteurs moléculaires, et caractérisé par une vitesse ; et (3) possibilité pour la molécule considérée de se fixer sur un ligand immobile, ce qui bloque son mouvement pendant une durée dépendante de la cinétique de liaison/dissociation. Ce changement d’état chimique répond en général à une cinétique du premier ordre, et on peut le décrypter quantitativement à travers la mesure de la mobilité. B-D. FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) et FCS (fluctuation correlation spectroscopy), deux méthodes de mesure de la mobilité des protéines dans la cellule, basées sur la variation du signal de fluorescence produit par des molécules préalablement marquées - protéines fluorescentes semblables à la green fluorescent protein ou marqueurs divers. B. La méthode de FRAP consiste à supprimer irréversiblement par photoblanchiment la fluorescence des molécules situées dans le volume choisi grâce une illumination locale intense. La fluorescence ne réapparaît dans ce volume que si des molécules non blanchies y pénètrent de nouveau. La cinétique de ce retour est très riche en informations quantitatives sur la nature de la mobilité, et permet de distinguer les trois scénarios mentionnés plus haut (A), voire des comportements hybrides, et d’extraire les caractéristiques quantitatives associées - constante de dissociation, coefficient de diffusion, ou encore la vitesse et la direction du transport. C. La méthode de FCS consiste à mesurer les fluctuations spontanées de la fluorescence dans un volume choisi, typiquement de l’ordre de 1 µm³, défini par la focalisation d’un faisceau laser. Si les molécules observées se déplacent, ces fluctuations accompagnent leur entrée et leur sortie du volume et nous renseignent donc quantitativement sur la mobilité. D’autres méthodes existent, basées sur la mesure des fluctuations d’intensité de fluorescence sur une série d’images - image correlation spectrosopy, speckle microscopy. D. Contrairement à la microscopie classique (faisceau coloré en jaune à gauche), l’excitation de la fluorescence en microscopie biphotonique est strictement restreinte au volume de focalisation, ce qui permet une mesure très locale de la dynamique (image de droite, mouvements vers et hors du volume photoblanchi). La mesure du retour de fluorescence par vidéomicroscopie 3D rapide fournit en outre des informations spatiales.