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Introduction

Depuis toujours, chercheurs et cliniciens ont eu recours à des modèles biologiques afin de comprendre les mécanismes cellulaires impliqués dans les maladies humaines et développer de nouveaux traitements. Les modèles animaux, qu’il s’agisse de mammifères, de poissons ou d’invertébrés tels que la drosophile et le nématode Caenorhabditis elegans, ont permis l’étude in vivo du comportement cellulaire dans un environnement tridimensionnel. Toutefois, il existe des limites à l’utilisation de ces modèles : logistiques, techniques (modifications génétiques, etc.), distance évolutive avec l’espèce humaine et considérations éthiques croissantes. La culture cellulaire in vitro, initiée dans les années 1950 avec les premières lignées humaines immortalisées, a orienté la recherche vers des systèmes bidimensionnels, souvent monocellulaires et éloignés de la complexité organique. Entre les approches in vivo et in vitro, les organoïdes, apparus dans les années 2000, représentent un modèle hybride. Cultivés en trois dimensions à partir de cellules souches, ils sont capables de reproduire l’architecture, la diversité cellulaire et certaines fonctions des organes humains. Les organoïdes se caractérisent par leur structure tridimensionnelle, l’origine des cellules utilisées : souches embryonnaires (ES pour embryonic stem), pluripotentes induites (iPS pour induced pluripotent stem) ou souches adultes (AS pour adult stem), leur capacité d’autoorganisation et de morphogénèse, et leur capacité à mimer le fonctionnement de l’organe modélisé. Leur émergence découle d’avancées conjointes en biologie du développement, en recherche sur les cellules souches et en ingénierie des cultures cellulaires.

Historiquement, les premières observations d’auto-agrégation cellulaire remontent au début du siècle avec les travaux de Van Peters Wilson chez l’éponge [1]. Les années 1950 ont vu l’établissement de la première lignée cellulaire humaine en culture [2], suivi d’études pionnières in vitro sur la réorganisation cellulaire au cours de l’embryogénèse [3]. Les découvertes des cellules souches hématopoïétiques [4], embryonnaires [5] et iPS (cellules souches pluripotentes induites) [6] ont défini les bases cellulaires des organoïdes. En 2008, Eiraku et al. ont obtenu le premier organoïde de cortex cérébral de souris à partir de cellules ES [7], suivi par la génération d’organoïdes cérébraux humains [8, 9]. Aujourd’hui, des organoïdes de rétine, moelle épinière, intestin, cœur, rein, foie et pancréas sont disponibles [1, 10].

Le principe des cultures d’organoïdes

Pour obtenir un organoïde à partir d’une culture homogène de cellules souches, la population cellulaire doit opérer une rupture de symétrie dans sa prolifération et son devenir, suivie d’une croissance et d’une maturation en organoïde. Ces caractéristiques d’auto-organisation et de morphogénèse sont essentielles à la culture d’organoïdes et miment les processus naturels de l’embryogenèse. In vitro, trois composantes sont utilisées afin de reproduire le contexte de l’embryogenèse : le type de cellules souche et leur nombre, la composition du milieu de culture contenant les facteurs morphogènes, et le type de support et de matrice extracellulaire utilisés pour cultiver les cellules.

Le type de cellules souches

Les cellules souches sont des cellules indifférenciées capables de s’autorenouveler par des divisions symétriques pour produire davantage de cellules souches, et de se différencier en divers types de cellules spécialisées par des divisions asymétriques. Il existe principalement trois types de cellules souches : les cellules souches embryonnaires (ES), les cellules souches adultes (AS) et les cellules souches pluripotentes induites (iPS).

Les cellules souches embryonnaires (ES) proviennent de la masse cellulaire interne des blastocystes, à savoir des embryons de six jours après la fécondation et contenant une centaine de cellules. Les cellules ES sont pluripotentes : elles peuvent se différencier dans tous les types de cellules du corps issues des trois feuillets embryonnaires. Les trois feuillets embryonnaires – l’endoderme, le mésoderme et l’ectoderme – sont formés très tôt au cours de l’embryogénèse, lors de la gastrulation, et donnent naissance aux différents tissus qui constitueront l’organisme entier.

Les cellules souches adultes (AS) sont présentes dans divers organes adultes et sont généralement multipotentes, c’est-à-dire qu’elles sont capables de se différencier en un nombre limité de types cellulaires spécifiques à leur tissu d’origine. Par exemple, les cellules souches hématopoïétiques de la moelle osseuse sont capables de donner naissance aux globules blancs, aux globules rouges et aux plaquettes [4]. Ainsi, les cellules souches adultes jouent un rôle crucial dans la réparation et la régénération des organes, mais elles ne peuvent produire in vitro que des organoïdes correspondant à leur feuillet embryonnaire d’origine.

Les cellules souches pluripotentes induites (iPS) sont des cellules adultes reprogrammées génétiquement pour retrouver un état pluripotent similaire à celui des cellules souches embryonnaires. Cette reprogrammation est obtenue par l’introduction d’un cocktail de facteurs de transcription qui réactivent les programmes d’expression des gènes caractéristiques des cellules souche embryonnaires pluripotentes [6]. Les iPS peuvent être dérivées à partir de différents types cellulaires adultes, tels que des fibroblastes de la peau ou des cellules sanguines mononucléées. Elles possèdent la capacité de proliférer indéfiniment et de former les trois feuillets embryonnaires, tout en évitant d’avoir recours aux cellules souches embryonnaires humaines.

De façon intéressante, les organoïdes issus d’AS sont plus matures et mieux adaptés à l’étude des tissus adultes. Les organoïdes dérivés de cellules ES ou iPS, plus proches du stade fœtal, sont souvent plus adaptés pour étudier l’organogenèse. Leur faible maturation résulte probablement du manque d’interactions cellulaires complexes ou d’un temps de culture insuffisant [11].

Les morphogènes

Les morphogènes sont des molécules de signalisation essentielles à l’orchestration du développement embryonnaire, notamment dans la mise en place des structures du système nerveux central. Ils agissent selon des gradients de concentration, permettant à une population cellulaire initialement homogène d’adopter des identités distinctes en fonction de leur position relative au centre de diffusion du signal [12]. Dans les systèmes de culture d’organoïdes, la supplémentation contrôlée en morphogènes permet de reproduire artificiellement ces gradients et d’induire la régionalisation des tissus. Parmi les morphogènes les plus couramment utilisés figurent les molécules WNT (Wingless-type MMTV Integration site family), SHH (Sonic Hedgehog), FGF (Fibroblast Growth Factor), BMP (Bone Morphogenetic Protein) et TGF-β (Transforming Growth Factor beta). La plupart des organoïdes sont dérivés d’une population cellulaire de départ organisée en sphères, exposée à des morphogènes spécifiques à des moments définis pour activer séquentiellement des processus développementaux souhaités. L’efficacité d’un gradient de morphogènes dépend non seulement de la stabilité de la protéine, mais aussi de sa capacité à interagir avec la matrice et à diffuser dans les tissus, et par conséquent l’efficacité dépend également du diamètre des sphères de cellules. Il est à noter que le nombre de cellules formant les sphères à l’initiation de la culture est capital pour orienter correctement le développement d’un organoïde [13].

Le développement embryonnaire de la moelle épinière repose sur l’établissement de gradients morphogénétiques dorso-ventraux et rostro-caudaux, qui déterminent avec précision l’identité des progéniteurs neuronaux. Deux sources principales de morphogènes agissent de manière opposée dans l’axe dorso-ventral : la plaque basale, à l’origine du plancher neural, sécrète SHH, tandis que la plaque du toit libère des facteurs des familles BMP et WNT. Le gradient ventral de SHH, issu de la notochorde puis du plancher neural, induit l’expression différentielle de facteurs de transcription tels que NKX2.2 (NK2 Homeobox 2), OLIG2 (Oligodendrocyte Transcription Factor 2), PAX6 (Paired Box 6), menant à la formation de domaines distincts responsables de la génération des motoneurones et des interneurones ventraux. Inversement, les gradients dorsaux de BMP et WNT spécifient les interneurones dorsaux [13, 14]. Ces interactions antagonistes permettent une régionalisation fine du tube neural, chaque sous-domaine générant une sous-population neuronale fonctionnellement spécialisée. La modulation expérimentale spatiotemporelle de ces voies morphogénétiques est donc essentielle pour orienter la différenciation des organoïdes neuraux vers une identité moelle épinière [15].

Le support et la matrice extracellulaire

Les conditions de culture des organoïdes varient en fonction de leur origine tissulaire et de leur stade de développement. Certaines cultures nécessitent une matrice extracellulaire tridimensionnelle, comme le Matrigel (un hydrogel naturel riche en laminine et collagène IV) ou des hydrogels synthétiques (basés sur des hydrogels de polyéthylène glycol, d’alginate ou de fibrine), qui offrent un support biomimétique essentiel à la structuration de l’organoïde et à la différenciation cellulaire [11]. D’autres types d’organoïdes, notamment les organoïdes cérébraux, peuvent être cultivés en suspension dans des conditions d’agrégation cellulaire, souvent dans des bioréacteurs ou sur des plaques à fond rond, permettant l’auto-organisation spontanée sans besoin de matrice externe. Enfin, certains protocoles, en particulier pour les organoïdes cutanés ou pulmonaires, exploitent une interface air-liquide. Les structures sont cultivées à la surface d’un filtre perméable, avec un accès direct à l’air sur leur face supérieure et un contact nutritif basal avec le milieu liquide [11]. Cette configuration favorise la stratification cellulaire, l’accès à l’oxygène et la maturation tissulaire imitant les conditions physiologiques des tissus exposés à l’environnement.

Les organoïdes neuromusculaires

Les organoïdes neuromusculaires (NMO pour neuromuscular organoid) constituent une avancée majeure pour la modélisation des interactions entre les neurones moteurs, les muscles squelettiques et les cellules de Schwann, offrant des opportunités uniques pour l’étude des maladies neuromusculaires et le développement de thérapies.

Image d’un organoïde neuromusculaire à 20 jours de développement, prise par un microscope à feuillet de lumière (Zeiss LigthSheet Z1). Les motoneurones sont révélés par le marquage SMI-31 (en vert). Les cellules musculaires sont révélées par le marquage de la desmine (en rouge). Échelle 100 µm. (© Laurent Coudert)

Modèles 3D auto-organisés

Récemment, la découverte des progéniteurs neuromésodermiques (NMP pour neuromesodermal progenitors), des cellules progénitrices à l’origine des lignages neuronaux et musculaires de la moelle épinière, a permis le développement des organoïdes neuromusculaires à partir d’iPS ou d’ES humaines [9]. L’équipe du docteur Gouti propose un protocole d’induction des cellules souches humaines en NMP par l’activation des voies WNT et FGF pendant trois jours. Ces cellules s’autoorganisent ensuite pour donner naissance aux principaux composants du système moteur périphérique : les motoneurones, les cellules musculaires et les cellules de Schwann. Après plus de 50 jours de culture, les NMO présentent des jonctions neuromusculaires fonctionnelles, des contractions rythmiques, et ils constituent un modèle pertinent pour l’étude de pathologies, telles que la myasthénie ou la sclérose latérale amyotrophique [9, 16]. Plus récemment, dans l’optique d’accroître la complexité des modèles neuromusculaires, Yin et al. ont décrit des organoïdes triplement différenciés, regroupant des neurones, des cellules musculaires et des cellules osseuses, désignés sous le terme d’organoïdes neuromusculosquelettiques humains (hNMSO pour human neuromusculoskeletal organoid) [17]. Le tissu osseux favorise le développement du muscle squelettique, rendant le modèle plus pertinent d’un point de vue physiologique. Ce modèle pourrait également offrir un cadre plus adéquat pour l’étude de pathologies neuromusculaires impliquant une atteinte du tissu osseux [4]. Malgré l’intérêt grandissant de la communauté pour ces nouveaux modèles, plusieurs limites subsistent, notamment une hétérogénéité structurale inter-organoïdes, une standardisation difficile, ainsi que des contraintes pour les analyses optiques et pharmacologiques à haut débit.

Modèles 2D auto-organisés

Pour contourner ces obstacles, l’équipe du docteur Gouti a développé en 2023 un modèle bidimensionnel (2D) du système neuromusculaire périphérique. Ce modèle présente l’avantage de combiner neurones moteurs, cellules musculaires et cellules de Schwann organisés en monocouche, formant des jonctions neuromusculaires fonctionnelles. L’utilisation de cellules iPS dérivées de patients atteints d’amyotrophie spinale (SMA) a permis de mettre en évidence une diminution du nombre de jonctions neuromusculaires et de la contraction musculaire [18]. L’approche 2D constitue ainsi une alternative compatible avec la standardisation des cultures cellulaires et les analyses à haut débit de composés pharmacologiques. Néanmoins, certaines limitations subsistent également, notamment la nécessité de dissocier les cultures à deux reprises – ce qui peut introduire de la variabilité – ainsi que l’absence d’une organisation tridimensionnelle.

Assembloïdes et puces microfluidiques

Parallèlement aux modèles auto-organisés, d’autres approches reposent sur l’assemblage dirigé de cellules différenciées ou d’organoïdes issus de tissus spécifiques. Ces constructions, appelées « assembloïdes », permettent par exemple la fusion d’organoïdes corticaux et spinaux avec des sphéroïdes musculaires, reconstituant ainsi un axe neuromusculaire [19]. Cette stratégie présente l’intérêt d’intégrer les circuits corticaux aux réseaux périphériques tout en offrant un contrôle précis des types cellulaires impliqués. La principale limite de cette approche réside dans la difficulté de production reproductible des différents tissus constitutifs, en raison d’une maturation cellulaire longue et d’une faible robustesse. De plus, ces modèles sont peu adaptés aux criblages pharmacologiques à haut débit.

Afin de simplifier cette approche, une alternative consiste à différencier séparément des neurones moteurs et des cellules musculaires à partir d’iPS humaines, puis à les assembler en 2D afin de reconstituer l’interaction neuromusculaire. Ces différents types cellulaires peuvent également être mis en culture dans des dispositifs microfluidiques : les corps cellulaires des neurones et les cellules musculaires sont placés dans des chambres séparées, reliées par des micro-canaux permettant le passage des axones [20]. Ces dispositifs permettent aussi d’étudier les interactions entre les organes dans le cadre d’approches « d’organe sur puce » reposant sur la culture d’organoïdes dans des chambres distinctes reliées par des canaux microfluidiques permettant l’échange de métabolites, de protéines, de vésicules ou d’ARN circulants. Ainsi, l’association d’un NMO avec des organoïdes hépatiques et cardiaques pourrait constituer une approche prometteuse pour étudier la toxicité hépatique et cardiaque de traitements ciblant le système neuromusculaire [21–22].

Perspectives cliniques et limitations

Applications cliniques des organoïdes

Les organoïdes neuromusculaires offrent un système innovant et physiologiquement pertinent pour la modélisation des maladies affectant le système neuromusculaire. Associés aux iPS issues de patients, les organoïdes neuromusculaires permettent de reproduire des modèles spécifiques de maladies génétiques telles que l’amyotrophie spinale, la sclérose latérale amyotrophique, les dystrophies musculaires ou les myasthénies congénitales. Ces modèles reproduisent des altérations structurelles (dégénérescence axonale, formation des jonctions neuromusculaires, anomalies de structure des fibres musculaires) et fonctionnelles (défaut de transmission synaptique et de contraction musculaire, hyperexcitabilité neuronale, réponse anormale à la stimulation), qui peuvent se révéler difficilement accessibles dans des modèles animaux ou cellulaires conventionnels. Ils constituent ainsi une plateforme précieuse pour l’étude mécanistique des maladies neuromusculaires humaines et le développement de stratégies de médecine personnalisée.

Le criblage pharmacologique sur organoïdes neuromusculaires représente également une avancée majeure dans le développement de thérapies ciblées. Ces modèles auto-organisés qui intègrent à la fois une variabilité cellulaire et une organisation structurelle, permettent d’évaluer in vitro l’efficacité et la toxicité de composés dans un environnement plus proche du tissu humain que les cultures cellulaires conventionnelles. Lorsqu’ils sont dérivés de cellules iPS de patients, les organoïdes offrent une plateforme personnalisée pour tester des médicaments en tenant compte des spécificités génétiques de chaque patient. Des approches à haut débit commencent à émerger, intégrant des outils d’imagerie automatisée, de transcriptomique ou d’électrophysiologie multicanaux (MEA pour multi-electrode array), pour permettre une évaluation quantitative et comparative de larges bibliothèques de composés. Cette stratégie ouvre la voie aux essais précliniques de candidats thérapeutiques efficaces et sûrs pour les maladies neuromusculaires.

Les défis

L’un des principaux défis actuels dans le domaine des organoïdes réside dans la reproductibilité et la standardisation des protocoles, deux conditions essentielles à leur utilisation fiable en recherche biomédicale et pour des applications cliniques. La formation d’un organoïde repose sur des processus auto-organisés hautement sensibles aux variations de nombreux paramètres : origine des cellules souches, composition du milieu, concentration des morphogènes, type de matrice extracellulaire, durée des étapes de différenciation, conditions de culture (oxygénation, agitation, densité cellulaire), etc. Ces variations peuvent induire une hétérogénéité importante entre les lots, entre les laboratoires, et même au sein d’un même protocole. Cette variabilité affecte la structure, la composition cellulaire, la maturation fonctionnelle et la réponse aux traitements, ce qui complique l’interprétation des résultats et limite la comparabilité entre études. Pour répondre à ces enjeux, des efforts croissants sont consacrés au développement de protocoles robustes, de milieux définis chimiquement, de matrices synthétiques standardisées et de systèmes automatisés de cultures. Ces enjeux ont été pris en compte par le gouvernement dans le plan France 2030 dans le cadre du PEPR (programmes et équipements prioritaires de recherche) Organoïdes et organes sur puces (MED-OoC). Enfin, l’évolution rapide de ces technologies soulève des questions éthiques majeures : provenance des cellules souches, protection des données génétiques, consentement éclairé et statut biologique de ces structures générées. Ces considérations imposent un encadrement rigoureux de la recherche, associé à un dialogue constant entre scientifiques, cliniciens, éthiciens et l’ensemble de la société. Ainsi, bien que les organoïdes neuromusculaires soient encore au stade du développement préclinique, leur potentiel pour faire progresser la compréhension des maladies neuromusculaires et le développement de traitements ciblés justifie un investissement soutenu dans les années à venir.

Liens d’intérêt

Les auteurs déclarent n’avoir aucun lien d’intérêt concernant les données publiées dans cet article.

Références

Liste des figures

	Image d’un organoïde neuromusculaire à 20 jours de développement, prise par un microscope à feuillet de lumière (Zeiss LigthSheet Z1). Les motoneurones sont révélés par le marquage SMI-31 (en vert). Les cellules musculaires sont révélées par le marquage de la desmine (en rouge). Échelle 100 µm. (© Laurent Coudert)
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