L’épigenèse est étroitement associée à la régulation de
l’expression des gènes. Elle contribue à leur expression
différentielle à la fois dans le temps et dans l’espace, et
participe ainsi au contrôle de leur état actif ou réprimé. Selon
une terminologie maintenant bien établie, les modifications
épigénétiques - ou marques épigénétiques - sont les facteurs qui
modifient l’expression des gènes de manière héritable au cours des
divisions cellulaires (en mitose, voire en méiose), sans impliquer
de modifications des séquences nucléotidiques concernées (selon
Robin Holliday [1]). Ces marques incluent les modifications
post-traductionnelles (méthylation, acétylation, phosphorylation et
myrystoylation) des parties aminoterminales des histones,
essentiellement des histones H2A, H2B, H3, H4, qui forment le cœur
protéique des nucléosomes, la méthylation de l’ADN, sa structure
locale (position des nucléosomes) et à longue distance
(organisation en domaines), mais aussi sa localisation nucléaire et
sa période de réplication pendant la phase S (Figure 1, [2])
(‹).
(‹) m/s 2005, n° 4, p. 371 et 384
De manière schématique, l’hétérochromatine (inactive) est
caractérisée par la désacétylation des histones H3 et H4, la
méthylation sur la lysine 9 de l’histone H3, la méthylation de
l’ADN, la condensation de la chromatine, une position de la
séquence à la périphérie du noyau et une réplication tardive au
cours de la phase S. À l’inverse, l’euchromatine (active) est
caractérisée par l’acétylation des histones H3 et H4, la
méthylation de H3 sur la lysine 4, une structure plus décondensée,
une position à l’intérieur du noyau et une réplication précoce en
début de phase S. Tous ces facteurs dépendent les uns des autres,
selon des mécanismes dont on connaît certains éléments, mais pas
encore parfaitement la hiérarchie. Par exemple, des protéines ayant
une forte affinité pour l’ADN méthylé peuvent s’associer à des
histones-désacétylases et méthyltransférases. Ainsi, la protéine
HP1 (heterochromatin protein 1), qui interagit avec l’histone H3
méthylée sur la lysine 9, peut elle-même recruter une histone
méthyltransférase (pour revue, voir [3]). En revanche, les
mécanismes gouvernant l’état de condensation, la localisation
nucléaire et le moment de la réplication sont beaucoup moins bien
connus. C’est l’ensemble de ces marques épigénétiques qui
permettent la répression (ou l’activation) de gènes spécifiques de
tissus dans les cellules différenciées, et le maintien de leur
profil d’expression au cours des divisions successives.
La reprogrammation reflète la capacité d’un noyau à modifier le
répertoire des gènes qu’il exprime normalement dans le tissu auquel
il appartient. Le terme reprend le concept de « programme », forgé
par François Jacob et Jacques Monod pour désigner la séquence
d’informations à la fois prédéterminée dans le génome, dépendante
du temps et nécessaire aux synthèses protéiques. Il suppose une
réorientation du déroulement de la séquence d’information. Une
définition récente propose de définir la reprogrammation comme « la
dominance moléculaire d’un type cellulaire sur un autre, conduisant
à donner à un noyau les caractéristiques du type cellulaire
dominant » [4]. Cette définition prend en compte le rôle
déterminant de l’environnement cytoplasmique bien mis en évidence
dans les expériences de transfert d’un noyau embryonnaire ou
somatique dans le cytoplasme d’un ovocyte énucléé (le type
cellulaire dominant).
Figure 1. Organisation chromatinienne d’un chromosome en mitose
et d’un noyau en interphase. En mitose, l’utilisation du Giemsa
révèle une organisation en bandes au sein des chromosomes. Ces
bandes (C, R et G) sont caractérisées par leur composition en
paires de bases A/T et G/C, leur contenu en séquences répétées et
en gènes, et la présence d’histones ayant subi des modifications
post-traductionnelles. En interphase, cette organisation se reflète
dans la distribution en euchromatine et en hétérochromatine au sein
des noyaux. Ainsi, les bandes R, contenant la majorité des gènes
actifs et enrichies en histones hyperacétylées, occupent la partie
centrale du nucléoplasme. En phase S, ce compartiment, appelé
euchromatine, se réplique précocement. À l’opposé,
l’hétérochromatine, contenant peu de gènes et d’histones acétylées,
se réplique tardivement. Globalement, l’hétérochromatine, enrichie
en protéine HP1 (heterochromatin protein 1), se répartit à la
périphérie du noyau et des nucléoles (constituant le compartiment
de synthèse ribosomique), à l’exception des régions
péricentromériques qui forment des « chromocentres » regroupant les
centromères de plusieurs chromosomes (d’après [2]).
Clonage et plasticité du noyau
Les premières expériences de reprogrammation datent maintenant
d’un demi-siècle (1952), lorsque Briggs et King obtinrent un têtard
après transplantation d’un noyau de blastula dans un ovocyte
énucléé de grenouille [5]. Dix ans plus tard, le laboratoire de J.
Gurdon produisit quelques grenouilles adultes, mais avec un plus
faible rendement, en utilisant des cellules différenciées de
l’endoderme intestinal [6, 7]. Ces expériences pionnières
montrèrent que, même si le rendement diminuait avec la progression
de la cellule donneuse vers l’état différencié, cet état montrait
une certaine « plasticité » et l’extinction de gènes
caractéristiques n’était pas irréversible, leur expression pouvant,
de fait, être réactivée.
Le déroulement complet d’un programme de développement à partir de
noyaux de cellules somatiques différenciées adultes n’a pu à ce
jour être obtenu que chez les mammifères. Une faible proportion des
embryons reconstitués, moins de 10 % seulement, est capable, dans
les cas les meilleurs, de donner des jeunes viables, et un tiers
environ de ces jeunes meurent dans les jours suivant la naissance.
Néanmoins, la plupart de ceux qui survivent peuvent se développer
apparemment tout à fait normalement [8]. L’existence de ces
quelques animaux (Figure 2) démontre que le cytoplasme de l’ovocyte
peut complètement reprogrammer l’activité d’un noyau
somatique.
Les faibles taux de développement obtenus après clonage sont dus à
la fois aux effets iatrogènes des techniques utilisées et aux
défauts de reprogrammation du noyau étranger [9]. Les premiers
événements qui se produisent après l’introduction du noyau dans le
cytoplasme ovocytaire sont en effet déterminants. Nous avons
notamment montré que la rupture initiale de l’enveloppe du noyau
donneur apparaît essentielle [10, 11] pour assurer un contact
intime entre la chromatine donneuse et le cytoplasme receveur.
C’est sans doute pour cette raison, ainsi qu’à cause de la
synchronisation entre le cycle cellulaire de la cellule donneuse et
celui du cytoplasme receveur [12], que le transfert d’un noyau
somatique en mitose s’accompagne d’une augmentation sensible du
taux d’embryons se développant au stade blastocyste. Cependant, la
reprogrammation reste un processus complexe car, même dans ces
conditions, le taux de développement à terme est très faible
(‹).
(‹) m/s 2002, n° 2, p. 169
Figure 2. Le clonage peut aboutir à la production
d’animaux physiologiquement normaux. A. Souris adulte clonée, âgée
de 30 mois, obtenue par transfert de noyaux somatiques (cellules de
cumulus) dans des ovocytes énucléés ; à cet âge avancé, l’animal
n’a manifesté aucune anomalie physiologique et ses descendants se
sont normalement reproduits. B. Courbe de poids de cette souris (en
bleu) et comparaison avec celle de deux témoins (en rouge) de la
même lignée (C57/CBA), issus d’une portée de deux animaux et
provenant d’embryons produits in vivo puis transplantés chez des
femelles porteuses au stade 2-cellules ; la souris clonée avait à
la naissance un poids semblable à celui des souris témoins (1,86 g)
; les courbes montrent une évolution pondérale similaire des
animaux tout au long de leur vie. C. Coupes histologiques du foie
et des poumons de la souris clonée, réalisées à 910 jours, et de
deux souris témoins adultes, âgées de 20 mois (602 jours) ; la
comparaison ne révèle aucune pathologie particulière.
Apport des fusions cellulaires (hétérocaryons) à
l’étude de la reprogrammation
Avant le succès du clonage, la plasticité de l’état différencié
avait déjà été étudiée dans les années 1980 au travers
d’hétérocaryons, produits de la fusion stable de deux types
cellulaires différenciés. En particulier, la fusion de cellules
primaires issues des trois lignages embryonnaires (endoderme,
mésoderme et ectoderme) avec des cellules musculaires primaires de
souris montra que, pour tous ces types cellulaires, des gènes
musculaires préalablement silencieux pouvaient être réactivés en
absence de synthèse d’ADN [13-15]. Ces expériences mirent en
évidence le rôle essentiel du dialogue entre cytoplasme et noyau
pour la modification de l’état différencié [16] ; elles montrèrent
aussi que des modifications de méthylation de l’ADN étaient
indispensables pour ces modifications de profil d’expression
[17].
Plus récemment, il a été rapporté que la mise en contact de noyaux
de fibroblastes avec des extraits de cytoplasme de lymphocytes T
provoquait l’expression de gènes spécifiques des lymphocytes T
[18]. Même si ces expériences n’ont encore pu être reproduites par
d’autres laboratoires, il est clair que cette démarche pourrait
permettre de déterminer le(s) facteur(s) cytoplasmique
responsable(s) de cette « reprogrammation ».
Encore plus récemment, des hétérocaryons entre des thymocytes de
souris, cellules à un stade final de différenciation, et des
cellules ES pluripotentes ont été réalisés. Il apparaît que le gène
marqueur de cellules pluripotentes, Oct4, est éteint dans les
thymocytes et réactivé dans les hétérocaryons, alors que des gènes
actifs des thymocytes, tels que Thy-1 et c-myc, sont éteints dans
les hétérocaryons. L’analyse fine du profil de méthylation de l’ADN
et des modifications des histones présentes dans les régions
promotrices de ces gènes suggère un schéma de « reprogrammation
nucléaire » dans lequel les modifications des histones et
l’établissement d’une structure décondensée de la chromatine
seraient l’étape intermédiaire indispensable, permettant ensuite
l’installation sur la chromatine de complexes activateurs ou
répresseurs spécifiques de chaque gène envisagé [19].
Le pouvoir du cytoplasme ovocytaire
Que ce soit chez les amphibiens ou chez les mammifères, la
reprogrammation de la chromatine implique d’importants mouvements
de protéines entre le noyau donneur et le cytoplasme receveur [20,
21]. Dans le cas du xénope, par exemple, 75 % des protéines
nucléaires sont perdues par le noyau donneur, et ces échanges
nucléocytoplasmiques s’accompagnent d’un gonflement important du
noyau, d’une forte diminution de son contenu en hétérochromatine et
de la disparition d’un nucléole fonctionnel [22, 23].
L’importance, dans ce remodelage, de facteurs nucléaires provenant
de l’ovocyte a été mise en avant par des données récentes obtenues
chez la souris [24]. Par ailleurs, les meilleures capacités de
remodelage sont obtenues, quelle que soit l’espèce mammifère
considérée, à partir d’ovocytes receveurs en métaphase II énucléés
(stade auquel se produit normalement la fécondation) : le
cytoplasme de ces ovocytes tirerait donc une partie au moins de son
pouvoir de reprogrammation de sa concentration en facteurs
nucléaires. Ce pouvoir n’est toutefois que transitoire : chez la
souris, le transfert d’un noyau, même embryonnaire, dans un ovocyte
énucléé juste après la fécondation est suivi d’une reprogrammation
très limitée de son activité, alors que la même opération effectuée
avant la fécondation permet un développement à terme [25]. Les
raisons de cette perte brutale du pouvoir de remodelage du
cytoplasme ovocytaire après la fécondation sont sans doute de deux
types : la ségrégation dans le noyau des protéines nucléaires
présentes dans le cytoplasme au stade métaphase II (et dont on a vu
plus haut l’importance) et l’ensemble des processus moléculaires
liés à l’activation de l’ovocyte, parmi lesquels l’activité
calcique : en effet, une modulation du signal calcique peut
modifier le cours du développement de l’embryon de mammifères
[26].
Même si c’est avec des rendements parfois très faibles, des animaux
normaux et féconds ont été obtenus par transfert de noyau somatique
provenant de types cellulaires très différents (Tableau I). Le
cytoplasme de l’ovocyte est donc capable de reprogrammer l’activité
de noyaux de cellules ayant atteint des stades avancés de
différenciation : ainsi, l’obtention de souris clonées viables à
partir de noyaux de cellules neuronales postmitotiques démontre que
le retour à l’état totipotent est aussi possible pour les noyaux de
cellules en différenciation terminale [27]. Toutefois, les chances
de succès deviennent alors très faibles : au laboratoire, alors que
nous obtenons régulièrement des clones bovins viables à partir de
noyaux de cellules fibroblastiques cutanées maintenues in vitro à
l’état proliférant, nous n’avons jamais pu mener à leur terme les
gestations induites à partir de noyaux de kératinocytes issus des
mêmes lots de cellules donneuses, mais différenciées à l’état
postmitotiques [28]. L’efficacité du clonage décroît
progressivement quand on passe des cellules embryonnaires
(blastomères) aux cellules fœtales, puis adultes : non seulement
les taux de développement à terme diminuent mais, de façon
surprenante, la mortalité fœtale tend à se manifester plus
tardivement au cours de la gestation [29] bien qu’il n’existe à
l’heure actuelle pas d’explication à cette observation. La durée
totale de la culture ou l’âge de l’animal donneur ne sont pas
directement en cause, mais bien l’état différencié du noyau. Comme
cela avait été montré chez les amphibiens au siècle dernier, les
possibilités de réorganisation du noyau vers un état totipotent
diminuent avec son état initial de différenciation mais,
contrairement à ce que l’on croyait alors, une reprogrammation
complète demeure possible.
Tableau I. Résultats de clonage obtenus dans plusieurs espèces
avec différents types de cellules donneuses (données non
exhaustives).
Reprogrammation et remaniements chromatiniens
Comme dans le cas des hétérocaryons, l’exposition rapide du
noyau somatique aux facteurs ovocytaires (cytoplasmiques et
nucléaires) se traduit d’emblée par de profonds remaniements de son
organisation : gonflement important, réduction de la quantité
d’hétérochromatine, disparition des nucléoles fonctionnels au
profit de pseudonucléoles (NLB, nucleolus-like bodies) [10] (Figure
3). Ces caractéristiques sont très similaires à celles des
pronoyaux d’un embryon normal, ce qui suggère à nouveau que la
morphologie « inhabituelle » des pronoyaux (par rapport à celle de
noyaux somatiques) n’est pas le fait de l’histoire antérieure des
deux ensembles de chromatine (ovocyte, d’une part, et
spermatozoïde, d’autre part), ni même de leur séparation, mais bien
le fait de l’exposition au cytoplasme ovocytaire. Ainsi, un facteur
« de disparition du nucléole » a été caractérisé dans l’ovocyte de
xénope [30].
Ces facteurs ovocytaires n’agissent sans doute pas de manière
immédiate, ainsi que le montre la Figure 3, qui présente en
parallèle l’état de condensation de la chromatine et la
distribution de la protéine spécifique de l’hétérochromatine HP1
après transfert d’une cellule ES (cellule souche embryonnaire) de
souris dans un ovocyte en métaphase II énucléé. Dans les cellules
d’origine, l’hétérochromatine péricentromérique de plusieurs
chromosomes se rassemble dans des compartiments caractéristiques,
appelés « chromocentres », fortement enrichis en protéine HP1
(ligne 1). En revanche, dans les pronoyaux d’embryons normaux, la
chromatine est globalement très décondensée, sauf autour des NLB,
où elle est partiellement marquée de HP1 (dernière ligne). Dans les
embryons clonés, on s’aperçoit que la distribution de HP1 est
uniforme dès 4 heures après activation ; elle reste en l’état tout
au long du cycle, à l’exception d’accumulations observables à la
périphérie des NLB (lignes 2, 3, 4). En revanche, 4 heures après
activation, la totalité des noyaux somatiques transférés ont
conservé des blocs de chromatine condensée. Six heures plus tard,
presque 70 % d’entre eux ont une chromatine de densité uniforme
(ligne 4), sauf à la périphérie des NLB où la chromatine condensée
est à nouveau fortement enrichie en HP1. La majorité des noyaux
obtenus 10 heures après fusion a ainsi une structure globale très
similaire à celles des pronoyaux d’embryons normaux. Les
modifications observées suggèrent un remaniement complet de
l’organisation des chromosomes : les séquences péricentromériques,
initialement associées entre elles dans les chromocentres, semblent
se disperser dans un premier temps pour finalement se concentrer
essentiellement à la périphérie des NLB, où elles sont à nouveau
associées à HP1. En outre, la dissociation de HP1 et la
décondensation de la chromatine ont suivi des cinétiques
différentes, suggérant que l’histone H3 méthylée sur la lysine 9,
cible de HP1, a été rapidement et uniformément déméthylée dans
l’hétérochromatine péricentromérique des noyaux transférés,
cependant que d’autres modifications des histones responsables de
la condensation de la chromatine se sont maintenues plus
longuement.
Par la suite, au stade 2-cellules, la structure nucléaire et la
répartition de HP1 dans les embryons obtenus par transfert de noyau
sont tout à fait similaires à celles des embryons normaux. Il en
est de même pour les histones de liaison de type H1, dont les
variants ovocytaires (histone H100) remplacent très rapidement
(dans les 5 minutes qui suivent l’introduction du noyau) et
apparemment complètement les histones H1 somatiques du noyau
étranger [31]. Ce retour d’une structure chromatinienne somatique à
un état de chromatine embryonnaire peut être considéré comme la
preuve d’une remise à zéro de son organisation, si ce n’est de son
activité fonctionnelle, par le cytoplasme ovocytaire.
Figure 3. Remodelage chromatinien des noyaux de cellules souches
embryonnaires (ES) au cours du premier cycle après transfert.
L’état des noyaux, après injection dans des ovocytes en métaphase
de deuxième division méiotique, puis activation, a été observé soit
par coloration directe de la chromatine au Hoechst (colonne de
gauche), soit par immunofluorescence indirecte utilisant un
anticorps dirigé contre la protéine HP1 (heterochromatin protein 1)
(colonne de droite). En comparaison avec les noyaux de cellules
donneuses (1re ligne), les noyaux transférés paraissent rapidement
remodelés (dès 4 heures après le transfert), bien qu’ils
conservent des blocs d’hétérochromatine. En revanche, 10 heures
après le transfert, 70 % des embryons clonés présentent déjà de
fortes similitudes avec les pronoyaux (issus de la décondensation
des gamètes) d’embryons fécondés in vivo (dernière ligne) : la
chromatine est répartie uniformément dans l’ensemble du
nucléoplasme, à l’exception des régions d’hétérochromatine,
enrichie en HP1, qui entourent les pseudonucléoles (barres
d’échelle : 5 mum).
Reprogrammation et méthylation de l’ADN
Chez les vertébrés, la méthylation de l’ADN sur les résidus
cytosines affecte 70 % à 80 % des dinucléotides CpG. Elle constitue
une modification épigénétique essentielle au développement, et
l’inactivation des gènes responsables de cette méthylation (gènes
des méthyltransférases de l’ADN DNMT-1, -3a ou -3b) induit chez la
souris de nombreuses anomalies de développement, voire une létalité
[32, 33] (‹).
(‹) m/s 2005, n° 4, p. 390
Cette modification paraît impliquée aussi bien localement dans
la répression transcriptionnelle de gènes isolés qu’au niveau d’un
chromosome entier, comme dans le cas de l’inactivation du X (pour
revue, voir [34]). Le degré de méthylation de l’ADN varie beaucoup
selon les tissus et leur état de différenciation.
Des modifications de méthylation très importantes ont lieu au cours
du développement embryonnaire pré-implantatoire, où elles
accompagnent la reprogrammation de la chromatine des gamètes de
l’état de totipotence (dans les blastomères) à l’état différencié
(dans les nouvelles lignées cellulaires du fœtus en formation), via
l’état de pluripotence (dans les cellules de la masse interne du
blastocyste). Une fois établi, le profil de méthylation spécifique
à chaque type cellulaire est relativement stable. C’est pourquoi la
reprogrammation du noyau transféré, c’est-à-dire la suppression du
profil de méthylation spécifique à la cellule donneuse et le
rétablissement d’un profil embryonnaire, semble indispensable dans
le cas du clonage.
Il est important de souligner que, chez les mammifères, la
reprogrammation des modifications épigénétiques au cours du
développement normal ne suit pas toujours la même cinétique. Ainsi,
seule la souris présente une déméthylation rapide et totale du
génome paternel juste après la fécondation [35] ; par la suite, le
degré de méthylation décroît à chaque réplication jusqu’au stade
blastocyste1, puis il y a reméthylation dans les
cellules de la masse interne au moment de l’implantation [36, 37].
Chez le bovin, nous avons montré que la situation est proche de
celle observée chez la souris, avec une déméthylation cependant
moins importante [38]. Plus différent encore, l’embryon ovin ne
subit qu’une déméthylation partielle entre la fécondation et le
stade 8-cellules, puis à nouveau au stade de blastocyste précoce
(Figure 4). Par la suite, aucune étape de reméthylation n’a été
mise en évidence, mais il est possible qu’elle ait lieu au cours de
la phase d’élongation du blastocyste avant l’implantation (14 jours
chez l’ovin).
De nombreuses études se sont récemment intéressées, en terme de
méthylation, au devenir du noyau donneur juste après son transfert
et au cours des cycles suivants. Ces études démontrent une
reprogrammation incomplète du profil somatique de méthylation en un
profil de type embryonnaire.
Ainsi, chez l’ovin, le noyau de la cellule somatique donneuse est,
après introduction dans l’ovocyte receveur, soit fortement méthylé
(répartition et intensité du profil de méthylation similaire à
celui observé avant transfert), soit partiellement déméthylé
(profil similaire à celui d’un pronoyau après fécondation in vivo)
[39]. Cette déméthylation serait due à un mécanisme actif, contrôlé
par l’ovocyte [40], et non encore identifié. Quant à l’absence de
déméthylation, observée dans plus de 50 % des embryons
reconstitués, elle pourrait être liée aussi bien à une
hétérogénéité dans la population d’ovocytes receveurs (par exemple,
une capacité de déméthylation variable) qu’à une hétérogénéité dans
la population de cellules donneuses (par exemple, un degré de
méthylation variable) [37]. On note en effet que, dans la majorité
des cellules donneuses cultivées sans sérum durant les cinq jours
précédant le transfert de noyau, le taux de DNMT1 et le degré de
méthylation global chutent. Plusieurs études réalisées chez
différentes espèces suggèrent une meilleure efficacité de clonage
avec ces cellules. Nous avons toutefois montré au laboratoire que
cette déprivation sérique n’était pas requise, par exemple chez le
bovin : dans cette espèce, les noyaux de cellules non privées de
sérum restent, après transfert dans des ovocytes, totalement
méthylés contrairement aux pronoyaux d’embryons fécondés in vitro
[38]. Des différences entre espèces ou dans la procédure de
transfert de noyaux pourraient donc aussi entrer en ligne de compte
dans le taux de réussite du clonage.
Aux stades suivants, ces deux types de profils de méthylation
(hyperméthylation et déméthylation partielle) peuvent toujours être
distingués. Cependant, le pourcentage d’embryons clonés
hyperméthylés décroît au cours du temps tandis que, parallèlement,
les pertes enregistrées à chaque clivage chutent, suggérant que les
embryons clonés hyperméthylés ne survivent pas aussi efficacement
que les autres (c’est-à-dire, les clones partiellement déméthylés)
au cours du développement pré-implantatoire (Figure 4) [39]. La
reprogrammation de cette marque épigénétique qu’est la méthylation
de l’ADN lors du transfert de noyau paraît donc corrélée au
développement de l’embryon, du moins jusqu’au stade blastocyste.
Mise à part cette étude, une seule autre équipe a observé une
corrélation entre le degré de reprogrammation du profil nucléaire
(en termes de méthylation de l’ADN et de méthylation de l’histone
H3 sur la lysine 9) et le pourcentage de développement jusqu’au
stade blastocyste [41].
Figure 4. Variations du degré de méthylation de l’ADN au cours
du développement pré-implantatoire chez l’ovin, après fécondation
in vivo ou transfert de noyau. Au cours du développement
préimplantatoire, les embryons fécondés in vivo (1re ligne)
subissent une déméthylation progressive du génome jusqu’à un
certain niveau qui se maintient jusqu’au stade blastocyste. À ce
stade, deux types cellulaires distincts apparaissent : le
trophectoderme, partiellement déméthylé, et la « masse cellulaire
interne » (ICM, inner cell mass), encore méthylée. En comparaison,
un nombre important d’embryons clonés produits par transfert de
noyaux de fibroblastes (2e ligne) présente aux cours des premiers
cycles un degré de méthylation plus élevé. De plus, au stade
1-cellule, ces embryons hyperméthylés présentent des focus
hyperméthylés intenses qui persistent après clivage. Cependant, le
pourcentage d’embryons clonés hyperméthylés décroît
progressivement, parallèlement au taux de perte entre chaque
clivage (courbes), ce qui suggère une corrélation positive entre
reprogrammation de la méthylation et capacité de développement. Par
la suite, plus de 20 % de pertes ont lieu à la transition 16
cellules/morula, lorsque le génome embryonnaire se met en route
(EGA, embryonic genome activation). Enfin, au stade blastocyste, 50
% des embryons clonés présentent une hyperméthylation des cellules
du trophectoderme. Immunofluorescence indirecte avec un anticorps
anti-méthylcytosine (barres d’échelle : 10 mum).
1 Il s’agit d’une déméthylation passive liée à la
réplication, la méthylation étant semiconservative (par opposition
à une déméthylation active qui ferait intervenir une
déméthylase).
Des points de contrôle distribués tout au long de la
vie embryonnaire
Les résultats présentés ci-dessus suggèrent que la
reprogrammation du noyau transféré, dès les premiers clivages, est
une étape cruciale pour le développement de l’embryon : il s’agit
là d’un premier point de contrôle. Ainsi, dans les embryons clonés
ne présentant pas une hyperméthylation, le degré de déméthylation
passive au cours des premiers stades est identique à celui observé
dans les embryons obtenus par fécondation in vivo, suggérant une
reprogrammation précoce efficace.
Cependant, à la transition 16-cellules/morula chez l’ovin, le taux
de perte augmente de nouveau significativement (Figure 4). Ce
deuxième point de contrôle d’une « bonne » reprogrammation coïncide
avec la mise en route du génome embryonnaire (EGA, embryonic genome
activation) dans cette espèce. Cette étape de transition entre
contrôle maternel et contrôle zygotique de l’expression des gènes
est indispensable à la poursuite de l’embryogenèse. À ce stade, la
déméthylation insuffisante de séquences réprimées dans les cellules
somatiques, mais nécessaires à l’embryon, pourrait être la cause
d’anomalies d’expression de gènes aboutissant à un défaut, voire un
arrêt, du développement.
En effet, les embryons ovins clonés qui ne se sont pas déméthylés
présentent de larges focus d’hétérochromatine fortement méthylés,
très similaires à ceux observés dans les cellules somatiques et
analogues aux chromocentres observés chez la souris (Figure 4). Au
cours du développement embryonnaire normal, ces focus ne sont
détectables qu’à partir du stade 8-cellules, leur formation
résultant d’une réorganisation nucléaire importante lors de l’EGA.
La persistance de ces focus, d’origine somatique, reflète des
défauts de remodelage de l’organisation nucléaire qui pourraient
altérer l’expression de gènes essentiels au développement et
s’exprimant à ces stades très précoces. Des focus hyperméthylés
similaires ont été observés après transfert de noyaux chez le bovin
[37] et des anomalies d’expression ont notamment été observées pour
plusieurs gènes dans des embryons bovins et murins clonés [42-44].
Chez la souris, il a été montré que le noyau transféré maintient
une activité transcriptionnelle de type somatique pendant plusieurs
cycles de division [45]. Des profils d’expression anormaux ont par
ailleurs été corrélés au blocage précoce (au stade de l’EGA) après
transfert interspécifique de fibroblastes embryonnaires de souris
dans des ovocytes bovins [46].
Les études conduites chez les ruminants montrent que, malgré ces
deux points de contrôle, au passage desquels on peut imaginer que
les clones mal « reprogrammés » ont arrêté leur développement, 50 %
des clones arrivant au stade blastocyste présentent une
hyperméthylation des cellules du trophectoderme, en comparaison
d’embryons fécondés in vivo. Or, de ces cellules dérivent en
majorité les tissus extra-embryonnaires (placenta, sac vitellin) ;
des anomalies de méthylation à ce stade pourraient conduire à un
défaut de placentation et d’implantation ainsi qu’à des problèmes
d’interactions entre tissus, notamment entre les tissus
embryonnaires et extra-embryonnaires. Cela pourrait expliquer les
perturbations dans le déroulement de la gastrulation, observées
chez la souris (A. Jouneau et al., article soumis pour
publication). Chez les ruminants, ces anomalies sont corrélées avec
les fortes pertes observées après introduction des blastocystes
clonés dans une femelle receveuse [29, 47]. Les premiers stades du
développement post-implantatoire constitueraient donc un troisième
point de contrôle.
Reprogrammation à l’échelle du génome ou
reprogrammation de gènes spécifiques ?
Bien que la reprogrammation de la méthylation globale de l’ADN
semble ici refléter la capacité de développement du clone, il faut
souligner la difficulté de déterminer clairement l’impact du degré
de reprogrammation d’un tel facteur épigénétique dans une situation
où le taux de réussite est faible et où l’on ne possède aucune
méthode d’analyse non invasive aux stades précoces, analyse qui
permettrait d’établir un lien direct entre facteur étudié et
développement à terme.
Les données établies chez la souris montrent que tous les animaux
issus de transfert de noyaux qui survivent après la naissance ont
en moyenne entre 0,2 % et 0,5 % des locus étudiés anormalement
méthylés [48]. C’est à la fois peu (4 locus seulement sur les 1 490
locus étudiés) et beaucoup si les locus touchés affectent des
fonctions essentielles de l’organisme. Toutefois, et dans l’état
actuel des données, il n’apparaît pas que la reprogrammation
induite par le transfert de noyau puisse être associée, chez les
clones, à une augmentation de la fréquence de tumeurs, souvent
reliée à des dérèglements épigénétiques [49]. D’un autre côté, il
est connu que des anomalies de méthylation de l’ADN au niveau de
certains îlots CpG peuvent affecter l’expression de gènes soumis à
empreinte [50]. Or, de telles anomalies se retrouvent chez les
clones murins [42, 51], et une partie des phénotypes anormaux
observés présentent de fortes similarités avec ceux attribués aux
défauts d’empreinte [52, 53]. De tels défauts d’empreinte peuvent
aussi résulter directement des conditions de manipulation des
embryons (et notamment des conditions de culture [54]), mais les
pertes au cours du développement sont généralement moins
importantes.
Il semblerait donc que certains locus sont particulièrement
sensibles aux variations épigénétiques et à la reprogrammation. Par
ailleurs, des polymorphismes dans la distribution de certaines
régions différentiellement méthylées pourraient expliquer les
différences importantes dans le taux de développement des embryons
clonés, pour un même type cellulaire, selon la lignée de noyaux
donneurs [55]. C’est pourquoi nous cherchons à présent à comparer
le profil de méthylation d’animaux clonés. L’établissement, pour un
tissu donné, de cartes spécifiques des régions différentiellement
méthylées [56], cartes établies à partir d’animaux clonés
physiologiquement normaux ou dont le développement a été compromis
au cours de la période fœtale, permettrait d’établir un lien direct
entre méthylation de l’ADN et capacité de développement, en
s’affranchissant du polymorphisme de séquence. Les données ainsi
acquises pourraient alors être utilisées comme de nouvelles
covariables dans les schémas classiques de sélection.
Conclusions
La reprogrammation des marques épigénétiques après tranferts de
noyaux se déroule comme au cours du développement normal,
c’est-à-dire de manière progressive sur plusieurs cycles mais avec
une cinétique souvent différente : le remodelage chromatinien juste
après introduction du noyau donneur est suivi d’étapes plus lentes
de modifications de la méthylation de l’ADN et des histones. L’idée
émergeant de ces analyses est celle de l’existence de plusieurs
points de contrôle, un premier durant les premiers clivages
précédant la mise en route du génome embryonnaire, un deuxième au
moment de la mise en place de la transcription embryonnaire et au
moins un troisième, avant (ou pendant) que se mettent en place les
axes de développement de l’embryon et s’établissent les premières
relations tissulaires entre l’embryon proprement dit et l’organisme
maternel (implantation).
Cependant, nous ne savons pas encore si les anomalies tardives du
développement si souvent observées chez les clones résultent
directement d’une reprogrammation incomplète du génome transféré au
moment des premières étapes de différenciation, ou indirectement de
défauts d’expression plus précoces de gènes spécifiques, par
exemple lors de la mise en route du génome. En effet, il est
maintenant bien établi, y compris sur le plan moléculaire, qu’en
dehors de toute « reprogrammation », des changements de
l’environnement maternel induits par des régimes alimentaires
spécifiques au début ou pendant la gestation, peuvent également
modifier la méthylation de l’ADN des descendants [57].
Mais cette « programmation fœtale » doit être distinguée de la
reprogrammation de l’activité du noyau après clonage.
Au vu de l’ensemble de ces données, le recours au clonage apparaît
comme une voie de recherche qui, bien qu’encore nouvelle, est
prometteuse pour définir la part de l’épigenèse dans la mise en
place et la réalisation d’un programme de développement.
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