Les dystrophinopathies sont des affections liées à des anomalies
de la dystrophine, protéine sub-sarcolemmique de 427 kDa. Celle-ci
est soit absente (dystrophie musculaire progressive et sévère de
Duchenne), soit présente mais diminuée et/ou altérée
qualitativement (dystrophies moins sévères de type Becker). Cette
hétérogénéité clinique est sous-tendue par une hétérogénéité des
mutations dans le gène DMD (2,4 Mb, 79 exons) qui est l’objet de
mutations très variables que l’on peut regrouper en deux catégories
affectant différemment la synthèse de la dystrophine : (1) les
grands remaniements touchant un ou plusieurs exons (délétions dans
60 %-70 % des cas, duplications dans 10 %-15 % des cas) ; (2) les «
petites » mutations intra- ou juxta-exoniques (mini-insertions ou
délétions, mutations ponctuelles de type non-sens direct, mutations
d’épissage).
En règle générale, la forme de Duchenne est due à des mutations
nulles, incompatibles avec une quelconque production de dystrophine
(mutations interrompant le cadre de lecture, comme les mutations
non-sens direct, les délétions ou insertions créant un codon
non-sens prématuré). Les formes moins sévères de type Becker sont
dues à des mutations compatibles avec la production d’une certaine
quantité de dystrophine. En ce qui concerne les grandes délétions
internes, de loin les plus fréquentes, la sévérité du phénotype
(Duchenne ou Becker) n’est pas conditionnée par leur étendue mais
par l’impact sur le cadre de lecture. De très grandes délétions
peuvent n’entraîner qu’un tableau clinique peu sévère si le cadre
de lecture est préservé. En effet, la distribution des 11 055
nucléotides de la séquence codante de l’isoforme musculaire de la
dystrophine (Dp427 = 427 kDa) sur les 79 exons du gène DMD ne
coïncide pas régulièrement avec le découpage en triplets. Ainsi, la
dystrophine, avec sa structure modulaire, et notamment son domaine
central constitué de 24 répétitions de motifs de type spectrine
(109 acides aminés), est une protéine tolérant l’ablation de
certaines régions internes, pourvu que la phase de la séquence
codante finale soit préservée. Cela a conduit au concept de modèles
réduits mais encore fonctionnels de la dystrophine :
mini-dystrophine, amputée de 46 % de la séquence peptidique [1] et
micro-dystrophine, amputée de 60 % [2], très utilisées dans les
essais de thérapie génique par transfert de gène. Compte tenu de
l’organisation des exons du gène DMD, on conçoit qu’une phase
abolie par une mutation (délétion ou mutation ponctuelle) puisse
être rétablie par l’exclusion d’un ou plusieurs exons si la phase
locale s’y prête. C’est ce qu’on appelle le saut d’exon
thérapeutique (SET) (en anglais, exon skipping). D’où l’idée
d’intervenir sur le processus d’épissage pour empêcher
l’incorporation de l’exon ou des exons choisis. Ces sauts d’exon
peuvent être induits par des oligonucléotides antisens (modifiés
pour résister aux RNases), complémentaires de séquences-clés qui
président à l’épissage du transcrit primaire. Dès 1991, M. Matsuo
[3] avait insisté sur l’importance des phénomènes d’épissage dans
le déterminisme et la thérapeutique des dystrophinopathies. Plus
récemment, d’autres groupes se sont engagés dans la voie de
l’épissothérapie, comme alternative à la thérapie génique classique
qui n’a pas encore remporté les succès escomptés [4-6]. Une
restauration de la synthèse de dystrophine musculaire chez la
souris mdx par exclusion post-transcriptionnelle de l’exon porteur
de la mutation (stop sur l’exon 23) a été rapportée par plusieurs
équipes [5, 6]. Mais ni l’efficacité, ni la stabilité
n’atteignaient un niveau de significativité clinique.
Figure 1. Construction pAAV-U7-SD23/BP22. Le U7snARN transformé
en U7-SD23/BP22 spécifique de l’exon 23 du gène de la dystrophine
murine est cloné entre les deux ITR d’un vecteur AAV2, encapsidé
ensuite dans un vecteur AAV de type 1. Ce U7snARN est inséré sous
le contrôle de son propre promoteur et de ses régions 3’
régulatrices, permettant l’expression d’un petit ARN modifié
U7-SD23/BP22.
Dans une publication récente [7], nous décrivons une nouvelle
stratégie d’épissothérapie qui a permis d’obtenir, chez la souris
mdx, une restauration efficace et durable de la synthèse de
dystrophine. Un mois après une injection unique intramusculaire ou
intra-artérielle d’un vecteur viral, l’AAV (adeno-associated
virus), portant diverses constructions (Figure 1) destinées à
empêcher l’incorporation de l’exon 23 dans le transcrit final, la
quasi-totalité des cellules du muscle injecté, ou des muscles du
membre perfusé, réexpriment un taux normal de dystrophine au niveau
du sarcolemme (Figures 2 et 3). Parallèlement, on observe la
réapparition à la membrane des protéines du complexe des
glycoprotéines associées à la dystrophine, et une restauration de
l’intégrité membranaire attestée par l’imperméabilité aux colorants
vitaux. Enfin, la plupart des fibres musculaires ont récupéré une
résistance normale à l’effort. Tous ces effets sont étonnamment
stables et se sont maintenus pendant 6 mois, recul dont nous
disposons aujourd’hui. Nous pensons ainsi avoir atteint un niveau
de significativité clinique. Le succès de la stratégie tient à la
nature des constructions employées : au lieu d’injecter des
oligonucléotides antisens libres, nous avons combiné
l’épissothérapie par oligonucléotide antisens à une technologie
classique de thérapie génique. Nous voulions obtenir, avec une
injection unique, une synthèse endogène d’antisens par un minigène,
et un effet thérapeutique durable. Ici, le produit du minigène
consiste en une séquence antisens appropriée, camouflée dans un
petit ARN nucléaire naturel, le snARN U7, qui est normalement
impliqué dans la maturation des transcrits d’histone (Figure 1)
[8]. L’ARN U7 chimère est produit sous l’influence de son propre
promoteur ; l’antisens antagoniste d’épissage qu’il contient n’est
pas reconnu comme une séquence exogène et échappe à la dégradation
par les RNases ; enfin, et surtout, il est produit en permanence.
La vectorisation dans le virus AAV (sérotype 2/1) est aussi un
élément très important, car ce vecteur est très efficace pour la
transduction des cellules musculaires.
Figure 2. Western blot sur protéines totales extraites des
muscles de souris mdx injectées. Détection de la dystrophine avec
l’anticorps monoclonal de souris NCL-DYS1 (Novocastra). La pointe
de flèche indique la taille de la dystrophine normale (427 kDa) qui
est détectée dans un muscle de souris normale C57Bl6 (échantillon
1). L’échantillon 2 représente le muscle mdx non traité, et les
échantillons 3 à 7 correspondent respectivement aux muscles
injectés avec l’AAV-U7(SD23/BP22), 2, 4, 8, 13 et 26 semaines après
traitement. La différence de taille attendue, d’environ 8 kDa entre
la dystrophine normale et la dystrophine restaurée, ne peut être
détectée sur ce gel.
Figure 3. Immunomarquage de la dystrophine avec l’anticorps
monoclonal de souris NCL-DYS2 (Novocastra). Immunomarquage sur
sections de muscles (tibialis anterior) de souris normale C57Bl6
(A), de souris mdx non traitée (B), de souris mdx 1 mois (C) et 6
mois (D) après l’injection de l’AAV-U7-SD23/BP22 (barres d’échelle
[A-D] : 0,5 mm).
Ces résultats encourageants suggèrent que la stratégie utilisée
pourrait être employée en thérapeutique humaine. Un premier
problème concerne l’éligibilité des patients pour une telle
approche. L’objectif que l’on vise par le SET est d’obtenir un taux
suffisant de transcrit lisible pour aboutir à une quantité de
protéine fonctionnelle capable de contrecarrer le processus
pathologique. Comme la dystrophine finale est amputée d’un ou
plusieurs exons, on peut prédire qu’elle se comportera comme une
dystrophine de type Becker. Cette assertion est objectivement
étayée sur les phénotypes Becker modérés, observés chez les malades
dont la délétion est identique à celle qui serait obtenue par SET.
Autrement dit, dans la majorité des cas, il s’agit d’obtenir la
transformation d’un phénotype DMD très sévère, en phénotype BMD.
Dans les rares cas où il existe déjà un certain taux basal de
transcrit normal, on peut espérer corriger la copie anormale du
transcrit et obtenir la transformation d’un phénotype BMD en
phénotype normal. Grâce à la base de données UMD-DMD, développée
par Christophe Béroud à partir de son modèle générique de base de
mutations spécifiques de locus [9], nous disposons d’un moyen de
sélectionner instantanément les cas éligibles pour un SET. En
effet, cette base, qui renferme plus de 800 cas documentés au point
de vue moléculaire, biologique et clinique, fournit automatiquement
pour chaque cas tous les paramètres requis : (1) conséquences
directes de toute mutation sur le cadre de lecture ; (2) tous
profils d’épissage qui seraient correcteurs de la phase ; (3)
taille de la dystrophine résultante ; (4) domaines protéiques et
épitopes qui seraient sacrifiés par le SET ; (5) carte des cibles à
viser par les oligonucléotides antisens pour obtenir un SET. Les
mutations justiciables du SET sont les délétions génomiques, les
mutations intra-exoniques bloquant le cadre de lecture et les
mutations introniques réactivant des exons cryptiques. Si l’on s’en
tient au saut d’un seul exon (mais le saut de plusieurs exons est
envisageable), plus de 300 cas seraient éligibles, soit 43 % de
l’effectif total des patients figurant dans la base UMD-DMD (83 %
si l’on ne tient compte que de la population présentant une grande
délétion Ž 1 exon). Il faut néanmoins souligner qu’il s’agirait
d’une thérapeutique à la carte, c’est-à-dire spécifique d’allèle.
Les exons à faire sauter sont de fréquence très inégale : avec 6
exons (45, 53, 51, 44, 50 et 8), on pourrait corriger 85 % des
délétions hors-phases (pour corriger 100 % des cas éligibles, il
faudrait cibler en tout 22 exons). Pour la correction des petites
mutations, le problème se complique par la grande diversité des
exons à cibler et les très faibles effectifs.
Un autre problème à résoudre avant de passer aux essais cliniques
est l’adressage. Par l’expérimentation animale (souris et chien
myopathes), nous nous employons à l’heure actuelle à élaborer une
méthode d’administration systémique permettant d’obtenir un
adressage généralisé à tous les muscles, en particulier aux muscles
respiratoires et cardiaque, et une bonne tolérance pharmacologique
et immunologique. Enfin, nous soulignons qu’a priori cette
stratégie n’est applicable qu’aux maladies génétiques résultant de
mutations récessives, touchant des gènes codant pour des protéines
modulaires contenant des motifs non essentiels. À cet égard, les
dystrophinopathies apparaissent comme un cas de figure
exceptionnellement privilégié.
Références
1. England S, Nicholson L, Johnson M, et al. Very
mild muscular dystrophy associated with the deletion of 46 % of
dystrophin. Nature 1990 ; 343 : 180-2.
2. Harper SQ, Hauser MA, DelloRusso C, et al. Modular
flexibility of dystrophin : implications for gene therapy of
Duchenne muscular dystrophy. Nat Med 2002 ; 8 : 253-61.
3. Matsuo M, Masumura T, Nishio H, et al. Exon skipping
during splicing of dystrophin mRNA precursor due to an intraexon
deletion in the dystrophin gene of Duchenne muscular dystrophy
kobe. J Clin Invest 1991 ; 87 : 2127-31.
4. Aartsma-Rus A, Bremmer-Bout M, Janson AA, et al.
Targeted exon skipping as a potential gene correction therapy for
Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord 2002 ; 12 (suppl 1)
: S71-7.
5. Dunckley MG, Manoharan M, Villiet P, et al.
Modification of splicing in the dystrophin gene in cultured Mdx
muscle cells by antisense oligoribonucleotides. Hum Mol Genet 1998
; 7 : 1083-90.
6. Lu QL, Mann CJ, Lou F, et al. Functional amounts of
dystrophin produced by skipping the mutated exon in the mdx
dystrophic mouse. Nat Med 2003 ; 9 : 1009-14.
7. Goyenvalle A, Vulin A, Fougerousse F, et al. Rescue
of dystrophic muscle through U7 snRNA-mediated exon skipping.
Science Express Online 2004, 4 novembre, 1104297 (à paraître le 3
décembre 2004).
8. Gorman L, Suter D, Emerick V, et al. Stable
alteration of pre-mRNA splicing patterns by modified U7 small
nuclear RNAs. Proc Natl Acad Sci USA 1998 ; 95 : 4929-34.
9. Béroud C, Collod-Beroud G, Boileau C, et al. UMD
(universal mutation database) : a generic software to build and
analyze locus-specific databases. Hum Mutat 2000 ; 15 : 86-94.
En marge de l’article qui vient de paraître sur la version
online de la revue Science [7], les auteurs ont accepté de rédiger
cette Dernière heure pour médecine/sciences.
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