Le paludisme constitue la première endémie parasitaire dans le
monde. Près de 40 % de la population mondiale vit en zone à risque
et on enregistre entre 300 et 500 millions de cas cliniques chaque
année avec plus de un million de décès, principalement des enfants
de moins de cinq ans [1, 2]. Le paludisme est causé par un
protozoaire du genre Plasmodium, qui infecte alternativement les
hôtes humains et des moustiques du genre Anopheles. Parmi les
quatre espèces à l’origine d’infections chez l’homme (Plasmodium
falciparum, P. vivax, P. malariae et P. ovale), P. falciparum
provoque les infections les plus graves, souvent mortelles.
De nombreux antipaludiques sont actuellement disponibles, mais le
parasite a développé des chimiorésistances, notamment aux molécules
les plus abordables pour les populations à risque (chloroquine et
association sulfadoxine/pyriméthamine) [3]. Seuls les dérivés
d’artémisinine et la quinine semblent, pour l’instant, épargnés par
les phénomènes de résistance. La mise en place de bithérapies ne
paraît plus suffisante pour contenir la maladie ; il est urgent de
développer de nouveaux antipaludiques aux mécanismes d’action
originaux et de faible coût [4].
Plasmodium entame son développement chez l’homme par une
multiplication dans les hépatocytes. Après une dizaine de jours,
les parasites sont libérés dans le sang et envahissent les
érythrocytes. Cette phase intra-érythrocytaire constitue la phase
symptomatique de la maladie avec une destruction massive des
hématies et parfois une adhérence aux vaisseaux sanguins des grands
organes comme le cerveau, restreignant le flux sanguin, avec de
graves conséquences (Figure 1A).
Figure 1. Cycle biologique et structure de Plasmodium chez
l’homme. A. Lors de son repas sanguin, le moustique du genre
Anopheles injecte le parasite sous forme sporozoïte. Les parasites
se multiplient dans les hépatocytes pendant une dizaine de jours
puis sont libérés dans le sang sous forme de mérozoïtes qui
envahissent les globules rouges. Cette prolifération
intra-érythrocytaire qui passe par trois stades successifs (anneau,
trophozoïte et schizonte) conduit à une destruction massive des
hématies et constitue la phase symptomatique de la maladie. Au
cours de cette phase, certains parasites se différencient en
gamétocytes mâles ou femelles, qui seront ingérés par un moustique
lors d’un repas sanguin sur un sujet impaludé. Après une
multiplication sexuée et une migration vers les glandes salivaires,
le moustique est prêt à infecter un nouvel hôte. B. Plasmodium,
bien que possédant sa propre membrane plasmique (PPM), se développe
à l’intérieur d’une vacuole parasitophore (PV) dont la membrane
(PVM) le sépare du cytoplasme érythrocytaire. Il possède les
organites habituels d’un eucaryote (noyau, réticulum endoplasmique
[RE] et appareil de Golgi rudimentaires, une mitochondrie [Mit])
ainsi que des organites spécifiques. Le complexe apical composé des
micronèmes (Mic), des rhoptries (R) et des granules denses (DG)
sert à l’invasion de la cellule hôte. La vacuole digestive (FV)
permet au parasite de dégrader l’hémoglobine en hème. L’apicoplaste
(A) est le vestige d’un plaste qui résulte d’une endosymbiose avec
une algue rouge. Au cours de son développement, le parasite met en
place dans le cytoplasme de l’érythrocyte un réseau membranaire
(TVN : réseau tubulovésiculaire, MC : corpuscules de Maurer)
impliqué dans le trafic moléculaire entre le parasite et la
membrane de l’érythrocyte (EPM) (d’après [13]).
Nous nous intéressons ici à la biogenèse membranaire de Plasmodium,
au cours de sa phase intra-érythrocytaire. Le parasite prolifère à
l’intérieur d’une vacuole parasitophore, dans l’érythrocyte mature,
une cellule ayant perdu son noyau et la capacité de synthétiser
protéines et lipides. Outre les organites habituels d’un eucaryote,
Plasmodium possède un complexe apical (micronèmes, rhoptries et
granules denses) servant à l’invasion, ainsi qu’une vacuole
digestive et un apicoplaste (Figure 1B). Pour assurer sa
prolifération (P. falciparum peut donner jusqu’à 30 nouveaux
parasites au cours de son cycle de 40-48 heures), le parasite
intracellulaire doit synthétiser de nombreuses membranes.
Contrairement à la plupart des organismes eucaryotes, les membranes
de Plasmodium sont dénuées de cholestérol et ont pour composante
lipidique essentielle des phospholipides. Les deux phospholipides
majoritaires sont la phosphatidylcholine (40-50 %) et la
phosphatidyléthanolamine (35-45 %) ; le phosphatidylinositol
représente jusqu’à 11 % tandis que la sphingomyéline y est quasi
absente [5]. Plasmodium doit posséder et met en place ses propres
voies de biosynthèse pour effectuer une néo-synthèse d’une quantité
considérable de phospholipides (jusqu’à 6 fois le contenu de la
cellule hôte). L’approche pharmacologique consiste à cibler cette
biosynthèse indispensable à la construction des structures
membranaires du parasite et donc à sa survie. Les phospholipides
sont synthétisés à partir de têtes polaires et d’acide gras puisés
dans le plasma. Ce métabolisme paraît unique par son intensité et
la multiplicité des voies métaboliques utilisées (Figure 2A). Il
combine des voies généralement présentes chez les procaryotes, les
eucaryotes et, encore plus remarquable, les plantes. La principale
voie de biosynthèse de phosphatidylcholine semble être la voie de
synthèse de novo, dite voie de Kennedy, qui met en jeu un système
d’import de choline et trois enzymes. Le laboratoire a aussi montré
que la sérine pouvait être décarboxylée en éthanolamine, suivi
d’une formation de phosphoryléthanolamine. Les données génomiques
ont montré qu’une activité phosphoryléthanolamine méthylase,
jusque-là uniquement décrite chez les plantes, pouvait prendre le
relais conduisant à de la phosphorylcholine, et ensuite à la
phosphatidylcholine. Ces voies de synthèse n’apparaissent pas
pouvoir se compenser et paraissent donc non redondantes [5].
Notre équipe a élaboré une stratégie utilisant des analogues de
choline potentiellement capables de bloquer l’import de choline
et/ou d’altérer une ou plusieurs des enzymes de synthèse de
phosphatidylcholine [5, 6]. Ces analogues ont été optimisés pour
leur activité antipaludique. Une première génération de
bis-ammonium quaternaire, dont G25 est le composé leader, a montré
une très puissante activité antipaludique à la fois in vitro et in
vivo [7-10]. Cependant, la structure chargée de ces molécules ne
leur permet pas un bon passage de la barrière gastro-intestinale,
empêchant ainsi une administration par voie orale. Nous avons donc
développé des pro-drogues neutres susceptibles de se convertir en
composés bis-thiazolium ayant une activité antipaludique in vitro à
moins de 10 nM. Ces composés sont actifs in vivo chez la souris à
de très faibles doses par voie parentérale ou orale, et cela à
faible ou haute parasitémie, et sont très faiblement toxiques (1
000 fois moins toxique sur les cellules de mammifères que sur
Plasmodium). L’administration orale de la prodrogue TE3 (3
mg/kg/jour pendant 4 jours) permet une cure complète et sans
recrudescence d’une infection par P. cynomolgi chez le singe Rhésus
[11]. Nous montrons aussi que les bis-thiazolium inhibent
spécifiquement la biosynthèse de phosphatidylcholine, sans toucher
la synthèse d’ADN ou des autres phospholipides [11]. De plus, ils
s’accumulent plus de 200 fois spécifiquement dans l’érythrocyte
infecté. Ce ciblage spécifique de nos produits vers les cellules
cibles est le rêve de tout pharmacologue et permet de travailler à
faible dose et ainsi d’éviter les effets cholinergiques de ces
produits. Enfin, nous avons récemment montré qu’une partie des
composés était accumulée dans la vacuole digestive du parasite
intracellulaire où ils peuvent interagir avec l’hème (métabolite de
l’hémoglobine, toxique pour le parasite), interaction qui paraît
contribuer à l’activité antiplasmodiale [12]. La puissance des
composés s’exprime par une activité cytotoxique non réversible
après un faible temps de contact (Figure 2B). Les bis-thiazolium
sont donc des antipaludiques uniques par leur accumulation
spécifique dans les érythrocytes infectés, leur double mécanisme
d’action et leur faible toxicité. Le métabolisme de la
phosphatidylcholine n’est la cible d’aucun antipaludique actuel, et
apparaît comme une alternative réaliste aux antipaludiques pour
lesquels une chimiorésistance existe.
Une collaboration avec Sanofi-Aventis est en cours afin
d’identifier les molécules candidates pour un développement
clinique.
Figure 2. Cible(s) et activité des nouveaux composés
antipaludiques. A. Métabolisme des phospholipides de Plasmodium. Ce
métabolisme est unique par l’association de voies métaboliques de
type procaryotes (voies CDP-DAG dépendantes), eucaryotes et
végétales. Le phospholipide majoritaire est la phosphatidylcholine
(PC) qui est synthétisée par trois voies métaboliques non
redondantes. La voie de synthèse de novo dite « voie de Kennedy »
permet la synthèse de PC à partir de choline plasmatique et met en
jeu trois enzymes : la choline kinase (CK), la CTP phosphocholine
cytidylyl transférase (CCT) et la choline phosphotransférase (CPT).
La phosphatidylcholine peut également être obtenue à partir de
sérine ou d’éthanolamine. Les produits des gènes caractérisés
biochimiquement sont surlignés en bleu. Les petites flèches rouges
indiquent les gènes identifiés dans le génome de P. falciparum. Les
gènes clonés et caractérisés (souvent par nos laboratoires) sont
surlignés en rouge et les gènes à caractéristiques végétales en
vert. Les points d’interrogation correspondent à des activités
biochimiques dont les gènes correspondants n’ont pas encore été
identifiés. CL : cardiolipide ; PE : phosphatidyléthanolamine ; PG
: phosphatidylglycérol ; PI : phosphatidyl inositol ; PS :
phosphatidylsérine (d’après [5]). B. Effet cytotoxique des
composés. Les composés sont caractérisés par une activité
cytotoxique puissante (qui se passe à faible concentration, < 10
nM), rapide (un temps de contact de 2 h avec le parasite suffit) et
non réversible. Ici, le composé T4 est mis en contact avec des
cultures synchrones de P. falciparum pendant des temps variables de
0 à 12 heures, à chacun de ses trois stades. La viabilité des
parasites est déterminée au cycle suivant [11]. Un contact des
parasites avec la drogue d’une heure seulement (stades anneau et
trophozoïte), ou 2 h (stade schizonte) suffit à inhiber la
croissance des parasites de 85-99 %. Cet effet cytotoxique est donc
rapide, se produit quel que soit le stade de développement du
parasite et paraît irréversible. Il est probablement dû à
l’accumulation spécifique des composés dans les érythrocytes
infectés (effet « cheval de Troie »).
Remerciements
Ces travaux ont bénéficié du support de l’Europe (contrat
QLK2-CT-2000-01166), du Ministère de l’Éducation et de la Recherche
(Pal+) et de l’Organisation Mondiale de la Santé.
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