Accès gratuit
Numéro
Med Sci (Paris)
Volume 17, Numéro 12, Décembre 2001
Page(s) 1343 - 1348
Section Mini-Synthèses
DOI http://dx.doi.org/10.1051/medsci/200117121343
Publié en ligne 15 décembre 2001

© 2001 médecine/sciences - Inserm / SRMS

Les anomalies de la croissance cellulaire par modification de l’expression de facteurs de croissance ou de leurs récepteurs sont des facteurs importants de la progression tumorale [1]. Parmi les facteurs de croissance pouvant être impliqués dans la tumorigenèse se trouvent les protéines de la famille des IGF (insulin-like growth factors) [2]. Ces peptides reconnaissent une protéine transmembranaire, le récepteur de type I des IGF (IGF-IR) doté d’une activité tyrosine kinase activable par la fixation des ligands [3]. Le ligand fixé sur son récepteur déclenche alors l’activation de plusieurs cascades de signalisation intracellulaire qui impliquent, entre autres, la voie des MAP kinases (mitogen activated protein) et celle des PI3 kinases (phosphatidylinositol-3) (figure 1) [2]. Grâce à l’activation de ces voies de signalisations intracellulaires, l’IGF-IR contrôle la croissance, la différentiation cellulaire et la maintenance du phénotype transformé des cellules malignes [3]. Le récepteur agit également en protégeant la cellule de l’apoptose et peut donc être considéré comme une protéine de « survie » permettant le développement de la cellule tumorale [3]. L’IGF-IR et ses ligands sont souvent surexprimés dans certaines lignées cancéreuses animales et dans quelques tumeurs humaines [2, 4]. Par exemple, chez la femme, l’expression de l’IGF-IR est 10 à 14 fois plus forte dans les cancers du sein que dans les tissus normaux [5]. Il apparaît donc intéressant de bloquer la fonction ou l’expression de l’IGF-I ou de son récepteur IGF-IR afin d’inhiber la croissance tumorale in vivo. A titre indicatif, les différentes stratégies expérimentales utilisées pour inhiber la voie de signalisation de IGF-IR sont présentées sur la figure 2. Les approches utilisant les ARN ou les oligonucléotides antisens dirigés contre les ARN messagers de l’IGF-IR ont conduit très récemment à des essais cliniques préliminaires [6].

thumbnail Figure 1.

Voies de signalisation du récepteur de l’IGF-I. La liaison de l’IGF-I sur son récepteur, IGF-IR, provoque la phosphorylation des tyrosines du récepteur qui peut alors activer par phosphorylation plusieurs substrats comme l’adaptateur Shc et les protéines IRS (insulin receptor substrate). Ces protéines activent alors d’autres protéines en aval comme les kinases MEK (mitogen extracellular regulated kinase) puis ERK (extracellular regulated kinase) et la voie de signalisation de la PI3-K. Toutes ces cascades peuvent conduire à la proliféra-tion, à la différenciation et à l’augmentation du métabolisme. La protéine kinase Akt activée par l’IGF-IR phosphoryle et inactive la protéine pro-apoptotique Bad, ce qui inhibe l’apoptose cellulaire (pour revue [2, 3]).

thumbnail Figure 2.

Différentes approches utilisées pour inhiber l’expression du récepteur de l’IGF-I. Le récepteur de l’IGF-I (IGF-IR) est un hétérotétramère α2/β2 composé de sous unités liées par des ponts disulfures. Des anticorps neutra-lisants et des anticorps simple chaine dirigés contre la partie extracellulaire α d’IGF-IR ont été utilisés pour inhiber la croissance tumorale [22]. Des récepteurs dominants négatifs correspondant à des protéines tronquées soit sur la sous unité intracellulaire (βm) soit sur la sous-unité extracellulaire (αm) bloquent également la fonction d’IGF-IR [23, 24]. Des analogues peptidiques de l’IGF-I inhibent la signalisation induite par IGF-IR en entrant en compétition avec le ligand IGF-I [25]. La fonction de l’IGF-IR peut aussi être bloquée par l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques de protéases impliquées dans le recy-clage du récepteur [26]. L’inhibiteur de protéase bloque la dégradation du ligand IGF-I normalement effectuée par la cathepsine B. Trois autres stratégies utilisant des acides nucléiques ont été utilisées pour inhiber l’expression d’IGF-IR. Les ARN antisens qui, en se fixant sur l’ARN messager du récepteur, bloquent sa traduction en protéine [9, 10, 1214, 17, 19, 20]. Les oligonucléotides antisens ont le même effet, ceci grâce à l’induction d’une ribo-nucléase spécifique, la RNase H [6, 10, 15, 27]. Des ARN peuvent aussi être dirigés contre l’ADN de l’IGF-I ou de l’IGF-IR via la formation de triple hélice afin d’inhiber leur transcription [11, 28].

Les ARN et oligonucléotides antisens

Les ARN et les oligonucléotides antisens inhibent la traduction de l’ARN messager sur lequel ils sont dirigés. Brièvement, l’ARN antisens complémentaire de l’ARNm, en formant un ARN double brin, bloque physiquement la machinerie ribosomale, tandis que les oligonucléotides antisens induisent, la plupart du temps, une ribonucléase spécifique, la RNase H, qui reconnaît l’hybride ARNm/oligonucléotide et dégrade le brin ribonucléique (pour revue, [7, 8]). L’ARN antisens est généralement synthétisé à partir de constructions plasmidiques qui peuvent être introduites dans les cellules tumorales soit in vitro par une transfection cellulaire avec des lipides cationiques [912], soit in vivo à l’aide d’un vecteur adénoviral [13] ou bien par injection directe d’ADN nu plasmidique au site de la tumeur [14].

Les oligonucléotides antisens qui représentent une bonne alternative aux ARN antisens peuvent être obtenus par synthèse chimique et pénètrent spontanément dans les cellules. Afin d’augmenter leurs effets biologiques, il apparaît parfois nécessaire d’une part de les rendre résistants vis-à-vis des nucléases biologiques en les modifiant chimiquement, et d’autre part d’ajouter des agents de transfection pour augmenter leur concentration intracellulaire. Il faut souvent adapter le couple oligonucléotide modifié et agent de transfection au type cellulaire que l’on désire transfecter in vitro [8]. Toutefois, les oligonucléotides antisens sont parfois utilisés sans addition de vecteurs de transport pour des expériences chez l’animal [10, 15]. Une revue récente pourra être consultée pour obtenir des détails sur les méthodes utilisées pour délivrer les oligonucléotides au sein des cellules et/ou des tissus [16].

Divers oligonucléotides antisens ont été dirigés contre l’ARNm de l’IGF-IR et ont été capables d’inhiber l’expression et la fonction du récepteur aussi bien in vitro qu’in vivo. Par exemple, il a été montré que des injections intradermiques répétées d’oligonucléotides antisens anti-IGF-IR provoquaient une régression significative de l’hyperplasie épidermique observée chez des souris nude greffées avec de la peau humaine atteinte de psoriasis [15]. L’IGF-IR est en effet fortement exprimé au sein des lésions de psoriasis et représentait donc une cible potentiellement intéressante dans le cadre de cette pathologie.

Récepteur de type I des IGF et glioblastomes

L’utilisation d’approches antisens a permis de démontrer que le récepteur de l’IGF-I jouait un rôle important dans la tumorigenèse in vivo de glioblastomes de rat (pour revue voir [17]). Le modèle utilisé est le développement de tumeurs après injection de cellules de glioblastome (C6) à des rats immuno-compétents BD-IX (figure 3). Les cellules de glioblastome de rat transfectées par un plasmide codant pour l’ARN antisens de l’IGF-IR (cellules C6T) n’expriment plus le récepteur et n’induisent plus la formation de tumeurs in vivo. Elles provoquent de plus une réponse antitumorale in vivo, protégeant le rat de l’apparition de tumeurs qui seraient induites après une seconde injection de cellules non transfectées [10, 17]. Enfin, des tumeurs déjà établies régressent après injection de ces cellules C6T (figure 3). Le fait d’inhiber l’IGF-IR dans une lignée tumorale a donc permis de disposer d’une sorte de vaccin cellulaire anti-tumoral empêchant tout développement ultérieur de tumeurs de même origine in vivo. Il est à noter que les modèles animaux utilisés dans ces expériences d’ARN antisens anti IGF-IR et anti IGF-I (voir paragraphe suivant) ne sont pas syngéniques avec les glioblastomes C6 et que la greffe peut être considérée comme allogénique [18]. Des effets biologiques similaires ont été observés lorsque les cellules C6 ont été préalablement traitées in vitro avec un oligonucléotide phosphorothioate antisens dirigé contre le codon d’initiation de la traduction du récepteur de l’IGF-I et réimplantées chez le rat soit directement, soit à l’aide d’une chambre de diffusion [17]. Ces chambres de diffusion sont des petites capsules dans lesquelles on peut placer des cellules pour les isoler du milieu extérieur par une membrane de 0,22 μm, ne laissant passer que les nutriments et les petites molécules. Lorsque les cellules C6 traitées avec l’oligonucléotide antisens ont été injectées dans des rats BD-IX, aucune tumeur ne s’est développée (figure 3). Si les mêmes cellules sont injectées dans les souris nude, les tumeurs se développent mais avec un retard de croissance significatif par rapport aux cellules non traitées (Tableau I). Grâce à l’utilisation des chambres de diffusion, les auteurs ont montré que les cellules traitées in vitro par l’oligonucléotide antisens anti IGF-IR mourraient par apoptose très rapidement lorsqu’elles sont introduites dans des souris nude ou des rats BD-IX [17]. Cette apoptose apparaît plus importante in vivo qu’en culture in vitro. Le même résultat a été obtenu avec des clones cellulaires exprimant l’ARN antisens anti-IGF-IR. Le retard de croissance des tumeurs in vivo est corrélé à la stimulation de cette apoptose. L’inhibition de l’IGF-IR par un ARN antisens ou un oligonucléotide antisens induit donc l’apoptose in vivo des tumeurs exprimant ce récepteur, confirmant ainsi le rôle anti-apoptotique de la voie de signalisation activée par l’IGF-IR.

thumbnail Figure 3.

Blocage de la tumorigenèse des glioblastomes in vivo par l’utilisation d’antisens anti IGF-IR. A. Les cellules de glioblastomes C6 sont transfectées soit avec un plasmide codant pour l’ARN antisens anti IGF-IR, soit avec un oligonucléotide antisens anti IGF-IR. Les cellules transfectées C6T sont ensuite injectées directement chez les animaux, ou placées dans des chambres de biodiffusion. B. Les glioblastomes C6 induisent le développement de tumeurs chez le rat BD-IX et la souris nude. Les cellules C6T ne sont plus tumorigènes chez le rat. Chez le rat, elles sont toutes entrées en apoptose. Chez la souris nude, les tumeurs ont un retard de croissance corrélé à la fraction de cellules survivantes. Lorsque les cellules C6T (encapsulées ou non) sont injectées à des rats présentant une tumeur pré-établie, on observe une régression tumorale. Si les rats sont traités préalablement avec les C6T, une seconde injection de cellules C6 non transfectées ne conduit à aucune tumeur. Cette résistance à une seconde injection tumorale est dépendante de la présence de lymphocytes CD8+ [17].

Outre cette apoptose massive, l’inhibition de l’IGF-IR provoque également une réponse immunitaire des rats traités impliquant des lymphocytes CD8+ (Tableau I). Selon les auteurs, des peptides partageant des caractéristiques communes avec les peptides portés par le complexe majeur d’histocompatibilité de classe I (CMH I), pourraient, en s’échappant à travers les pores des chambres de biodiffusion, être cytotoxiques pour les tumeurs et également immunogéniques [17].

Tableau I.

Injections de cellules de glioblastomes à des rats BD-IX et des souris nude.

Le ligand IGF-I et les tumeurs

Une induction similaire de l’apoptose et de la réponse immunitaire anti-tumorale est observé lorsque le ligand du récepteur, l’IGF-I, est inhibé par un ARN antisens dans des glioblastomes C6 [9, 19]. L’inhibition de l’IGF-I coïncide avec l’apparition des antigènes du CMH I et de la molécule co-activatrice B7 au niveau de la membrane des cellules C6 exprimant l’ARN antisens anti-IGF-I [12]. Dans ce cas, ces protéines membranaires pourraient participer à l’induction de la réponse immunitaire anti-tumorale. Dans un autre modèle, le système syngénique d’hépatocarcinome de rat LFC2A, on observe aussi une inhibition de la croissance tumorale in vivo [12]. L’injection de la lignée d’hépatocarcinome de rat dont l’IGF-I est neutralisé provoque en effet moins de tumeurs que les cellules non transfectees et, dans 60 % des cas, induit une régression des tumeurs préétablies. La réponse au traitement est cependant partielle comparée à celle obtenue avec les glioblastomes [12]. Une analyse plus détaillée a permis de montrer que les cellules d’hépatocarcinome exprimant l’ARN antisens anti IGF-I, surexprimaient aussi l’antigène du CMH de classe I, mais pas les molécules B7. L’absence de cette protéine membranaire pourrait expliquer la réponse partielle du traitement avec les ARN anti IGF-I. Très récemment, l’approche ARN antisens anti IGF-I a été couplée à l’expression de la molécule B7.1 afin d’obtenir un effet anti-tumoral [20]. Les cellules murines d’hépatomes et de carcinomes du côlon, du fait de leur faible immunogénicité, induisent le développement de tumeurs chez des souris nude, scid et syngéniques [20]. L’expression de l’ARN antisens anti IGF-I et de la protéine B7.1 dans ces cellules (par double transfection) a permis de disposer d’un vaccin cellulaire provoquant l’éradication de tumeurs préexistantes de même origine dans des modèles de souris syngéniques [20]. Afin de démontrer le rôle fondamental joué par la réponse immunitaire dans l’éradication des tumeurs chez ces souris syngéniques, des expériences similaires ont été effectuées chez des souris immunodéprimées (scid et nude). De façon attendue, aucune régression de tumeur préexistante n’a été observée après injection de cellules exprimant B7.1 et l’antisens anti IGF-I.

Essais pilotes chez l’homme

Les astrocytomes malins sont des tumeurs intracrâniennes humaines qui résistent ou répondent partiellement aux traitements classiques de chirurgie, de radiation, et de chimiothérapie. Les malades atteints de glioblastomes décèdent rapidement, la médiane de survie étant de 48 semaines. L’expression de l’IGF-IR et de son ligand IGF-I apparaît légèrement supérieure dans des gliomes humains par rapport à des tissus normaux du cerveau (pour revue sur l’expression de la famille des IGF dans les tumeurs humaines, voir [4]). Après les résultats encourageants obtenus chez les rats et les souris nude avec les oligonucléotides antisens anti IGF-IR, des études pilotes chez l’homme ont été entreprises pour analyser la faisabilité d’un tel traitement anti-tumoral dans le cas de glioblastomes. Douze patients, atteints de glioblastomes ou d’astrocytomes anaplasiques ayant résisté aux traitements thérapeutiques classiques et exprimant IGF-IR, ont participé à cet essai clinique [6]. Après exérèse partielle des tumeurs, les cellules tumorales sont dissociées puis placées en culture in vitro. Les cellules adhérentes obtenues sont traitées directement avec l’oligonucléotide antisens anti IGF-IR pendant au moins 6 heures, puis collectées et placées dans des chambres de diffusion. Plusieurs chambres, contenant chacune un million de cellules, sont réimplantées de façon autologue dans une poche de l’abdomen du patient. Après 24 heures, les capsules de diffusion sont récupérées et leur contenu analysé. Dans tous les cas, les cellules tumorales récupérées sont incapables de proliférer à nouveau en culture, mais 2 % de ces cellules sont toutefois intactes excluant le bleu trypan. L’introduction des chambres de diffusion contenant ces cellules tumorales traitées par l’oligonucléotide anti IGF-IR a conduit à des améliorations cliniques et radiographiques remarquables chez huit des douze patients traités (trois parmi ces huit ont été traités deux fois). Chez deux patients, les tumeurs primaires ont disparu temporairement. Malgré l’observation d’une rechute tumorale et une seconde chirurgie, la survie globale de ces deux patients semble avoir augmenté après ce traitement [6]. Comme le soulignent les auteurs, deux critiques majeures peuvent être portées sur ces premiers résultats chez l’homme. Tout d’abord, on ne peut exclure que la réponse antitumorale observée soit purement fortuite, sans rapport avec le traitement. De plus, s’il s’agit bien d’une réponse biologique au traitement, le mécanisme anti-tumoral impliqué reste à identifier [6]. Connaissant les résultats obtenus chez le rat, les auteurs ont d’abord recherché l’existence d’une réponse immunitaire induite par le traitement avec les chambres de diffusion. Si quelques patients ont bien présenté une infiltration lymphocytaire au niveau de la tumeur, celle-ci n’est pas observée chez tous les patients et il reste difficile de conclure de façon sûre à l’existence d’un mécanisme immunodépendant. Les auteurs proposent également que les cellules des glioblastomes, traitées ex vivo avec l’oligonucléotide antisens et réinjectées, meurent par apoptose en libérant dans le milieu des facteurs peptidiques [6]. Dans cette hypothèse, ces petits peptides seraient d’une part cytotoxiques pour la tumeur et d’autre part capables de déclencher une réponse immunitaire anti-tumorale chez le patient.

Conclusions

L’inhibition de la croissance tumorale et l’induction de l’apoptose obtenues en inhibant l’expression de l’IGF-I ou de son récepteur dans des tumeurs animales, notamment dans des glioblastomes de rat, a conduit naturellement les chercheurs à tester ces approches antisens en thérapeutique humaine. Ainsi, des essais cliniques utilisant des ARN antisens anti IGF-I sont actuellement en cours chez des patients atteints de glioblastomes à Cleveland (USA), et de carcinomes du colon et du sein à Cracovie (Pologne). Les premiers essais cliniques utilisant des oligonucléotides antisens anti IGF-IR appliqués ex vivo sur les tumeurs chez des patients atteints de glioblastomes ont démontré la faisabilité et la non toxicité du traitement [6]. Si des améliorations transitoires radiographiques et cliniques ont même été observées chez certains patients [6], il convient toutefois de rester prudent vis-à-vis de ces réponses biologiques qui pourraient n’être que fortuites [6]. D’autres essais cliniques restent à effectuer avant de savoir si cette approche thérapeutique peut non seulement améliorer la vie du patient, mais aussi détruire complètement les tumeurs et empêcher toute rechute tumorale. Notons que ces stratégies ARN et oligonucléotides antisens pourraient également s’appliquer à d’autres cancers, comme les cancers de la prostate, du sein, et des poumons où il a été montré que le récepteur de l’IGF-I jouait un rôle essentiel [2, 4, 13, 21]

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Liste des tableaux

Tableau I.

Injections de cellules de glioblastomes à des rats BD-IX et des souris nude.

Liste des figures

thumbnail Figure 1.

Voies de signalisation du récepteur de l’IGF-I. La liaison de l’IGF-I sur son récepteur, IGF-IR, provoque la phosphorylation des tyrosines du récepteur qui peut alors activer par phosphorylation plusieurs substrats comme l’adaptateur Shc et les protéines IRS (insulin receptor substrate). Ces protéines activent alors d’autres protéines en aval comme les kinases MEK (mitogen extracellular regulated kinase) puis ERK (extracellular regulated kinase) et la voie de signalisation de la PI3-K. Toutes ces cascades peuvent conduire à la proliféra-tion, à la différenciation et à l’augmentation du métabolisme. La protéine kinase Akt activée par l’IGF-IR phosphoryle et inactive la protéine pro-apoptotique Bad, ce qui inhibe l’apoptose cellulaire (pour revue [2, 3]).

Dans le texte
thumbnail Figure 2.

Différentes approches utilisées pour inhiber l’expression du récepteur de l’IGF-I. Le récepteur de l’IGF-I (IGF-IR) est un hétérotétramère α2/β2 composé de sous unités liées par des ponts disulfures. Des anticorps neutra-lisants et des anticorps simple chaine dirigés contre la partie extracellulaire α d’IGF-IR ont été utilisés pour inhiber la croissance tumorale [22]. Des récepteurs dominants négatifs correspondant à des protéines tronquées soit sur la sous unité intracellulaire (βm) soit sur la sous-unité extracellulaire (αm) bloquent également la fonction d’IGF-IR [23, 24]. Des analogues peptidiques de l’IGF-I inhibent la signalisation induite par IGF-IR en entrant en compétition avec le ligand IGF-I [25]. La fonction de l’IGF-IR peut aussi être bloquée par l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques de protéases impliquées dans le recy-clage du récepteur [26]. L’inhibiteur de protéase bloque la dégradation du ligand IGF-I normalement effectuée par la cathepsine B. Trois autres stratégies utilisant des acides nucléiques ont été utilisées pour inhiber l’expression d’IGF-IR. Les ARN antisens qui, en se fixant sur l’ARN messager du récepteur, bloquent sa traduction en protéine [9, 10, 1214, 17, 19, 20]. Les oligonucléotides antisens ont le même effet, ceci grâce à l’induction d’une ribo-nucléase spécifique, la RNase H [6, 10, 15, 27]. Des ARN peuvent aussi être dirigés contre l’ADN de l’IGF-I ou de l’IGF-IR via la formation de triple hélice afin d’inhiber leur transcription [11, 28].

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thumbnail Figure 3.

Blocage de la tumorigenèse des glioblastomes in vivo par l’utilisation d’antisens anti IGF-IR. A. Les cellules de glioblastomes C6 sont transfectées soit avec un plasmide codant pour l’ARN antisens anti IGF-IR, soit avec un oligonucléotide antisens anti IGF-IR. Les cellules transfectées C6T sont ensuite injectées directement chez les animaux, ou placées dans des chambres de biodiffusion. B. Les glioblastomes C6 induisent le développement de tumeurs chez le rat BD-IX et la souris nude. Les cellules C6T ne sont plus tumorigènes chez le rat. Chez le rat, elles sont toutes entrées en apoptose. Chez la souris nude, les tumeurs ont un retard de croissance corrélé à la fraction de cellules survivantes. Lorsque les cellules C6T (encapsulées ou non) sont injectées à des rats présentant une tumeur pré-établie, on observe une régression tumorale. Si les rats sont traités préalablement avec les C6T, une seconde injection de cellules C6 non transfectées ne conduit à aucune tumeur. Cette résistance à une seconde injection tumorale est dépendante de la présence de lymphocytes CD8+ [17].

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